新發(fā)現(xiàn)！轉(zhuǎn)錄組修飾與細(xì)胞自噬間的溝通

自噬對(duì)于維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏至關(guān)重要，而調(diào)節(jié)自噬的營(yíng)養(yǎng)傳感器在此前已有報(bào)道。然而，像m6A這樣的轉(zhuǎn)錄組修飾在調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的自噬中的作用尚不清楚。本研究中，展示了m6A讀取器YTHDF3對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用。m6A修飾上調(diào)促進(jìn)自噬形成和營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)溶酶體溶解。METTL3耗盡導(dǎo)致m6A修飾功能缺失，抑制YTHDF3介導(dǎo)的自噬通量。YTHDF3通過(guò)識(shí)別FOXO3 mRNA停止密碼子周?chē)膍6A修飾位點(diǎn)來(lái)促進(jìn)自噬。YTHDF3還會(huì)招募eIF3a和eIF4B來(lái)促進(jìn)FOXO3的翻譯，進(jìn)而啟動(dòng)自噬。本研究于2022年10月4日發(fā)表在期刊《Nature communications》上，IF：17.694。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、YTHDF3上調(diào)是自噬誘導(dǎo)所必需的

為識(shí)別參與自噬的潛在的轉(zhuǎn)錄因子，作者進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中因營(yíng)養(yǎng)缺乏而上調(diào)的蛋白質(zhì)。作者發(fā)現(xiàn)m6A讀取器YTHDF3的水平顯著增加（圖1a），并用WB驗(yàn)證了它的上調(diào)。在營(yíng)養(yǎng)匱乏期間，YTHDF3水平顯著上升的同時(shí)，其他的YTH家族蛋白沒(méi)有明顯變化（圖1b）。這一發(fā)現(xiàn)與最近報(bào)道的缺氧YTHDF1上調(diào)表達(dá)有所不同。

分析是否YTHDF3誘導(dǎo)與自噬體的出現(xiàn)密切相關(guān)，作者用兩種不同的shRNA表達(dá)慢病毒敲低MEFs中YTHDF3。分析LC3-II存在或不存在溶酶體抑制劑bafilomycin A1（Baf.A1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默YTHDF3自噬體通量受損。作為自噬的另外一個(gè)指標(biāo)，p62是一種自噬載體蛋白，能在自噬溶酶體中降解。而在對(duì)照細(xì)胞中，營(yíng)養(yǎng)饑餓誘導(dǎo)p62降解，YTHDF3消融導(dǎo)致p62積累（圖1c），也表明自噬通量減少。WB分析顯示，與KD對(duì)照相比，YTHDF3恢復(fù)的營(yíng)養(yǎng)缺乏MEF內(nèi)源性LC3-II和p62降解水平均顯著增加（圖1d），證明YTHDF3挽救了shRNA誘導(dǎo)的自噬失活。YTHDF3的缺失持續(xù)且顯著降低了胞質(zhì)中GFP-LC3點(diǎn)狀聚集（圖1e-f），而這種缺陷可以通過(guò)重新表達(dá)YTHDF3來(lái)挽救（圖1g-h）。此外，還發(fā)現(xiàn)YTHDF3過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)自噬標(biāo)志物的表達(dá)，降低p62水平（圖1i），表明YTHDF3不僅是維持生理性自噬所必需的，還介導(dǎo)了自噬增強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)也得到了GFP-LC3實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，該實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)異位表達(dá)YTHDF3，細(xì)胞質(zhì)中的GFP-LC3斑點(diǎn)數(shù)量增加（圖1j-k）。透射電鏡（TEM）證實(shí)YTHDF3確實(shí)導(dǎo)致自噬小體和自溶小體數(shù)量大幅減少（圖1l）。這些數(shù)據(jù)表明YTHDF3是一個(gè)正調(diào)控因子，是在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)誘導(dǎo)自噬所必需的。

圖1 YTHDF3上調(diào)是自噬誘導(dǎo)所必需的

2、YTHDF3衰竭損害了自噬小體的形成和溶酶體的功能，mTORC1和AMPK信號(hào)不受YTHDF3的影響

作者進(jìn)一步研究YTHDF3 KD細(xì)胞中自噬的哪個(gè)步驟被中斷。通過(guò)使用熒光標(biāo)記的串聯(lián)mCherry-GFP-LC3報(bào)告蛋白，測(cè)量自噬體和自溶酶體的豐度。在營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件下，YTHDF3的損失使非酸性植物(mCherry+GFP+)和酸性(mCherry+GFP?)點(diǎn)狀數(shù)量急劇減少，說(shuō)明明自噬小體的形成和自噬通量均嚴(yán)重受損（圖2a-b）。

在哺乳動(dòng)物中，自噬通過(guò)ULK1復(fù)合物的刺激而啟動(dòng)。當(dāng)ULK1復(fù)合物被激活時(shí)，將III PtdIns3K復(fù)合物的組分磷酸化，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上形成特化的Ptdins3P enated豐富子結(jié)構(gòu)域。為探測(cè)YTHDF3是否有助于早期細(xì)胞自噬的形成。作者發(fā)現(xiàn)敲低YTHDF3抑制饑餓誘導(dǎo)的ULK1和ATG13的點(diǎn)形成（圖2c-d），表示UKL1復(fù)合體向吞噬體起始位點(diǎn)的易位受到了影響。與ATG13一致，在饑餓條件下敲低YTHDF3使ATG14點(diǎn)的形成和PtdIns3P結(jié)合蛋白DFCP1顯著減少（圖2c-d）。這些結(jié)果說(shuō)明YTHDF3耗盡損害早期的自噬體形成，包括起始和成核。作者選擇Acridine orange（AO）作為染色劑（綠），用Baf.A1處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，分析YTHDF3是否通過(guò)同時(shí)影響溶酶體活性來(lái)調(diào)節(jié)自噬通量。結(jié)果顯示YTHDF3-KD細(xì)胞紅綠熒光強(qiáng)度比降低（R/GFIR）（圖2e），說(shuō)明沉默YTHDF3可以增加溶酶體pH值。LysoTracker Red staining也證實(shí)了這一結(jié)果（圖2f-g）。接下來(lái)，作者調(diào)查沉默YTHDF3是否影響溶酶體的水解功能。作者將DQ-Red BSA載入對(duì)照組和YTHDF3 KD細(xì)胞中，DQ-Red BSA在被溶酶體蛋白酶降解時(shí)釋放熒光單體。YTHDF3 KD細(xì)胞中紅色熒光減弱，表明細(xì)胞內(nèi)蛋白水解減少（圖2h-i）。因?yàn)椴煌膬?nèi)吞率可能會(huì)影響DQ-Red BSA販運(yùn)到溶酶體中，作者使用cell-permeant Magic Red測(cè)量組蛋白酶B活性。結(jié)果顯示YTHDF3 KD細(xì)胞只具有較低的Magic Red（圖2j-k），提示溶酶體組織蛋白酶活性受損。這些結(jié)果表明YTHDF3耗盡損害自噬體的形成，導(dǎo)致溶酶體功能障礙。

基于上述結(jié)論，作者考慮YTHDF3是否影響上游mTORC1和AMPK信號(hào)的活性。作者通過(guò)測(cè)定mTOR在S2448和mTORC1下游靶點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)來(lái)分析mTORC1活性，包括p70S6K在T389和4E-BP1在T37/46。在對(duì)照組和YTHDF3 KD細(xì)胞中，mTOR S2448、p70S6K T389和4E-BP1 T37/46的磷酸化水平在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)顯著降低（圖2l）。作者通過(guò)測(cè)量AMPK α在T172和AMPK底物RAPTOR在S792的磷酸化水平來(lái)評(píng)估YTHDF3是否調(diào)節(jié)AMPK活性。AMPK α T172和RAPTOR S792的磷酸化水平在營(yíng)養(yǎng)饑餓時(shí)顯著增加，而YTHDF3 KD細(xì)胞中的變化模式與對(duì)照組細(xì)胞相同（圖2m）。這些數(shù)據(jù)表明，mTORC1和AMPK信號(hào)不受YTHDF3的影響。

圖2 YTHDF3衰竭損害了自噬小體的形成和溶酶體的功能

3、YTHDF3需要METTL3介導(dǎo)的m6A修飾來(lái)促進(jìn)自噬

為評(píng)估自噬過(guò)程中m6A的變化，作者使用一種識(shí)別m6A修飾核酸的抗體進(jìn)行了免疫熒光分析。研究發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)m6A信號(hào)于細(xì)胞質(zhì)中積累（圖3a-b）。同時(shí)，YTHDF3也在這一過(guò)程中積累（圖3a-b）。用oligo（dT）純化的Poly（A）+ RNA在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)m6A修飾顯著增加（圖3c），提示mRNA的m6A水平在自噬誘導(dǎo)過(guò)程中升高。

作者希望鑒別了負(fù)責(zé)mRNA的m6A超甲基化的m6A編碼器，發(fā)現(xiàn)只有METTL3在營(yíng)養(yǎng)匱乏條件下顯著誘導(dǎo)（圖3d）。敲低METTL3降低自噬誘導(dǎo)過(guò)程中mRNA的高甲基化（圖3e）。這說(shuō)明METTL3在營(yíng)養(yǎng)匱乏條件下對(duì)m6A的誘導(dǎo)是必需的。

作者觀察到d3-m6A與RNA探針的摩爾比在饑餓后6小時(shí)下降（圖3f），表明METTL3的催化活性下降。有趣的是，METTL3蛋白水平在長(zhǎng)時(shí)間饑餓中沒(méi)有顯著變化（圖3g）。作者推測(cè)這可能是細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)耗竭狀態(tài)下的一種代償機(jī)制。研究使用兩種不同的shMETTL3慢病毒感染過(guò)表達(dá)YTHDF3的MEFs，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)饑餓誘導(dǎo)的LC3-II積累和p62降解顯著減弱（圖3h）。是否METTL3對(duì)ythdf3促進(jìn)自噬的作用依賴于其m6A催化活性，作者將野生型或催化突變型METTL3重新引入到METTL3沉默的細(xì)胞中，并表明野生型METTL3，而不是催化突變型，可以挽救自噬缺陷METTL3沉默細(xì)胞（圖3i）。與這些結(jié)果一致的是，一項(xiàng)mCherry-GFP - LC3串聯(lián)報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，在過(guò)表達(dá)YTHDF3的MEFs中，營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，METTL3的損耗會(huì)影響自噬體和自溶酶體的生成（圖3j-k），并且野生型METTL3可以恢復(fù)這種功能失活，而催化突變體則不能（圖3l-m）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明YTHDF3需要METTL3介導(dǎo)的m6A修飾來(lái)促進(jìn)自噬。

圖3 YTHDF3需要METTL3介導(dǎo)的m6A修飾來(lái)促進(jìn)自噬

4、受抑制的RPS27a-METTL3相互作用使METTL3在饑餓下穩(wěn)定

為測(cè)試METTL3是否參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者首次分析營(yíng)養(yǎng)缺乏狀況下，METTL3 mRNA豐度。研究結(jié)果顯示在營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件下，METTL3 mRNA豐度小幅度增加（圖4a）。然后作者檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)饑餓是否影響METTL3 mRNA的穩(wěn)態(tài)，沒(méi)有觀察到顯著差異（圖4b）。但METTL3蛋白營(yíng)養(yǎng)饑餓時(shí)上調(diào)在一個(gè)經(jīng)典的蛋白酶抑制劑MG132的治療下完全消除了（圖4c）。這表明營(yíng)養(yǎng)缺陷下METTL3是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的主要控制因子。環(huán)己酰亞胺（CHX）的chase實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一觀點(diǎn)，揭示了饑餓狀況減弱METTL3蛋白的降解（圖4d）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)饑餓顯著降低METTL3泛素化（圖4e）。為識(shí)別與METTL3相互作用的潛在調(diào)控因子，并解釋其在饑餓反應(yīng)中去泛素化的原因，作者在MEFs中過(guò)表達(dá)Flag標(biāo)記的METTL3，并將抗Flag免疫沉淀物進(jìn)行質(zhì)譜分析。令人驚喜的是，作者發(fā)現(xiàn)了6個(gè)泛素化相關(guān)蛋白與METTL3共化，包括RPS27a，RPL23，RPL11，RPS2，RPS3和HSPA5（圖4f）。研究數(shù)據(jù)揭示營(yíng)養(yǎng)饑餓減緩了RPL27a與METTL3的相互作用，增加了RPL11和RPL23與METTL3的相互作用（圖4f-g）。而且RPS27a，RPL23和RPL11的表達(dá)沒(méi)有受到饑餓的顯著影響（圖4h）。這些結(jié)果說(shuō)明這些蛋白質(zhì)與METTL3的相互作用將影響METTL3蛋白的泛素化和穩(wěn)定性。作者檢測(cè)了MEFs中METTL3的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，這些MEF轉(zhuǎn)染了分別靶向RPS27a，RPL23和RPL11的siRNA，發(fā)現(xiàn)siRPS27a MEFs中METTL3上調(diào)，但RPL11或RPL23敲低的MEFs中METTL3沒(méi)有顯著變化（圖4i）。因?yàn)镽PS27a是一種泛素融合蛋白，它可以釋放活性泛素單體，介導(dǎo)蛋白的泛素降解，所以作者研究了RPS27a是否導(dǎo)致METTL3泛素化。結(jié)果顯示RPS27a強(qiáng)烈減弱的METTL3泛素化抑制（圖4j）。這些結(jié)果表明，營(yíng)養(yǎng)饑餓時(shí)RPS27a-METTL3相互作用受損導(dǎo)致METTL3泛素化抑制，從而增強(qiáng)METTL3穩(wěn)定性。

圖4 受抑制的RPS27a-METTL3相互作用使METTL3在饑餓下穩(wěn)定

5、YTHDF3識(shí)別饑餓誘導(dǎo)的FOXO3 mRNA的m6A高甲基化

接下來(lái)，作者嘗試識(shí)別營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)與不同的YTHDF3結(jié)合的mRNA。發(fā)現(xiàn)了1041個(gè)上調(diào)的，1814個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子（圖5a）。分析這些結(jié)合位點(diǎn)，m6A核心基序“GGAC”被高度檢測(cè)到（圖5b）。大多數(shù)的這些結(jié)合位點(diǎn)定位在蛋白編碼轉(zhuǎn)錄和高度聚集在CDS和3’UTR區(qū)域，特別是在停止密碼子附近（圖5c），與m6A峰的分布模式一致。因此，作者推斷在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)mRNA能與YTHDF3結(jié)合主要依賴于m6A修飾。

隨后，作者發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)期，共2811個(gè)mRNA的m6A峰增多和2552個(gè)mRNA的m6A峰減少（圖5d）。

為鑒別營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)與YTHDF3結(jié)合增加潛在的m6A高甲基化靶點(diǎn)，作者將營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)YTHDF3 RIP-seq富集峰與超m6A峰交叉，得到了86個(gè)峰（圖5e）。在這86個(gè)峰中，有7個(gè)基因被注釋到GO-term自噬（0006914），包括FOXO3，BMF，DDIT3，AP4M1，SESN2，ZFYVE1和ZFYVE26（圖5e）。RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YTHDF3營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，這些自噬相關(guān)轉(zhuǎn)錄本中FOXO3富集的最為顯著（圖5i），并且都依賴于METTL3。

根據(jù)研究數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，F(xiàn)OXO3 mRNA中的m6A高甲基化峰位于終止密碼子周?chē)腃DS和3'UTR區(qū)域（圖5f）。MeRIP-qPCR分析驗(yàn)證沉默METTL3減少了由于營(yíng)養(yǎng)缺乏而在FOXO3轉(zhuǎn)錄本停止密碼子周?chē)鶦DS和3'UTR區(qū)域的m6A峰，也減弱了m6A高甲基化水平（圖5g-h）。與FOXO3 mRNA衰減的m6A同步，YTHDF3與FOXO3 mRNA的結(jié)合相應(yīng)減少（圖5i）。作者使用重組YTHDF3蛋白和含有不同F(xiàn)OXO3的CDS或序列的生物素化RNA探針進(jìn)行了電泳遷移率轉(zhuǎn)移試驗(yàn)（EMSAs）3'UTR加或不加m6A修飾。結(jié)果表明，一旦從RNA探針上去除m6A修飾，無(wú)論m6A位于FOXO3的CDS或3'UTR中，YTHDF3與探針之間的相互作用都顯著減弱（圖5j-k）。此外，由于與YTHDF3結(jié)合的探針1或3的觀察到的帶強(qiáng)度顯著高于與YTHDF3結(jié)合的其他探針，作者推斷FOXO3-CDS上2158 nt、2151 nt、2163 nt（探針1）和2295 nt（探針3）的m6A位點(diǎn)對(duì)于YTHDF3識(shí)別FOXO3終止密碼子區(qū)域可能比其他m6A位點(diǎn)更關(guān)鍵（圖5j-k）?？傊?，這些結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)缺乏期間，METTL3介導(dǎo)的m6A高甲基化是YTHDF3 - FOXO3 mRNA相互作用所必需的。

圖5 YTHDF3識(shí)別饑餓誘導(dǎo)的FOXO3 mRNA的m6A高甲基化

6、FOXO3是YTHDF3促進(jìn)自噬的關(guān)鍵

為研究YTHDF3在調(diào)節(jié)FOXO3表達(dá)中的作用，研究敲低YTHDF3，發(fā)現(xiàn)在正常和營(yíng)養(yǎng)饑餓條件下，FOXO3蛋白水平都顯著降低（圖6a）。相應(yīng)地，YTHDF3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致FOXO3表達(dá)增加（圖6a）。沉默YTHDF3導(dǎo)致參與自噬起始、成核、擴(kuò)張和自噬溶酶體融合的FOXO3靶點(diǎn)的mRNA水平降低，而過(guò)表達(dá)YTHDF3導(dǎo)致這些基因的表達(dá)上調(diào)（圖6b）。WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些變化（圖6c）。數(shù)據(jù)顯示，在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)，p-FOXO3（S413）水平在細(xì)胞核中增加，在細(xì)胞質(zhì)中減少，其方式與總組分類(lèi)似（圖6a）。另一方面，作者檢測(cè)到YTHDF3 KD細(xì)胞中pFOXO3（S413）水平下降，而YTHDF3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致相反的效果。然而，磷酸化FOXO3與泛FOXO3的比值不受明顯影響（圖6a）。這些結(jié)果表明，YTHDF3可能在調(diào)節(jié)FOXO3的翻譯中起關(guān)鍵作用，而不是FOXO3翻譯后修飾如磷酸化。通過(guò)沉默或過(guò)表達(dá)YTHDF3，大部分FOXO3參與自噬的靶基因包括在mRNA和蛋白水平上均有顯著變化。然而，四個(gè)基因（BECN1、ATG12、ATG4A和ATG4C）的蛋白水平變化非常輕微，而它們的轉(zhuǎn)錄水平卻發(fā)生了顯著變化（圖6b-c）。作者認(rèn)為這可能是由于基因特異性和細(xì)胞類(lèi)型依賴性基因表達(dá)規(guī)則的差異。接下來(lái)，作者研究了METTL3缺失后FOXO3的表達(dá)情況。在正常和饑餓條件下，敲低METTL3明顯抑制了YTHDF3過(guò)表達(dá)MEFs細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中FOXO3的表達(dá)水平（圖6d）。在METTL3沉默的細(xì)胞中，細(xì)胞核中的FOXO3明顯低于對(duì)照細(xì)胞，因?yàn)樗陴囸I的反應(yīng)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核（圖6d）。此外，參與自噬的FOXO3靶基因的大部分蛋白水平也被METTL3敲除減弱，而被METTL3過(guò)表達(dá)增強(qiáng)（圖6e）。然而，在沉默或過(guò)表達(dá)METTL3的MEFs中也檢測(cè)到FOXO3靶點(diǎn)表達(dá)的差異（圖6e）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明YTHDF3具有調(diào)節(jié)作用FOXO3的表達(dá)和改變FOXO3靶向自噬基因的表達(dá)依賴于METTL3。

為確定受損的FOXO3表達(dá)是否導(dǎo)致YTHDF3缺陷細(xì)胞的自噬功能障礙，研究進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)（圖6g）。在YTHDF3缺陷的細(xì)胞中異位表達(dá)FOXO3，挽救了在Baf.A1存在和不存在的情況下自噬標(biāo)志物水平的降低，挽救了p62的降解（圖6h），恢復(fù)了FOXO3靶基因的表達(dá)水平（圖6i-j）。利用mCherry-GFP-LC3報(bào)告載體，作者證明了FOXO3的異位表達(dá)極大地恢復(fù)了YTHDF3缺陷引起的自噬體形成和自噬流缺陷（圖6k-l）。為進(jìn)一步確定FOXO3在YTHDF3調(diào)節(jié)自噬中的作用，敲除FOXO3并檢測(cè)YTHDF3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，沉默FOXO3顯著阻礙YTHDF3促進(jìn)的LC3-II水平上調(diào)和p62降解（圖6m）。mCherry-GFP-LC3報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，敲除FOXO3抑制饑餓時(shí)YTHDF3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的自噬體和自溶酶體的形成（圖6n-o）。這些結(jié)果表明FOXO3是YTHDF3促進(jìn)自噬的關(guān)鍵功能靶點(diǎn)。

圖6 FOXO3是YTHDF3促進(jìn)自噬的關(guān)鍵

7、YTHDF3促進(jìn)FOXO3翻譯，但是不影響其mRNA的穩(wěn)定性

作者想知道YTHDF3調(diào)控FOXO3表達(dá)的機(jī)制。敲除YTHDF3并沒(méi)有影響FOXO3 mRNA的水平（圖7a），這表明YTHDF3可能對(duì)FOXO3的翻譯有影響。多聚體分析證明了這種破壞YTHDF3在40S/60S核糖體和80S單體部分顯著增加，在多聚體部分顯著減少（圖7b）。YTHDF3缺陷細(xì)胞的翻譯池（多體）中FOXO3 mRNA的水平低于對(duì)照細(xì)胞（圖7c），表明YTHDF3的缺失減弱了FOXO3的翻譯。

為解決FOXO3-CDS中m6A位點(diǎn)對(duì)YTHDF3促進(jìn)FOXO3轉(zhuǎn)譯的影響，作者生成了野生型和突變型FOXO3-CDS表達(dá)結(jié)構(gòu)。上游CDS的m6A突變基序（FOXO3-CDS-mut2）作為對(duì)比。數(shù)據(jù)顯示FOXO3-CDS-mut1而不是FOXO3- CDS -mut2消除了YTHDF3增強(qiáng)的FOXO3表達(dá)（圖7d），這表明FOXO3- CDS中終止密碼子附近的m6A位點(diǎn)在YTHDF3促進(jìn)FOXO3的翻譯中起著關(guān)鍵作用。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)YTHDF3促進(jìn)FOXO3翻譯。鑒定出的FOXO3的3’ UTR部分，被克隆到pEZX-MT06載體中報(bào)告基因螢火蟲(chóng)熒光素酶的3 ' UTR區(qū)域（圖7e）。這些結(jié)果表明FOXO3-中終止密碼子附近的m6A位點(diǎn)3'UTR區(qū)域也參與調(diào)節(jié)YTHDF3 FOXO3翻譯。

此外，作者還研究了YTHDF3是否調(diào)節(jié)FOXO3 mRNA的穩(wěn)定性。用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D（actinomycin D，Act D）處理，在對(duì)照組和YTHDF3缺陷細(xì)胞組之間無(wú)顯著差異（圖7h），表明YTHDF3不影響FOXO3 mRNA的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)表明，YTHDF3促進(jìn)FOXO3的翻譯取決于它對(duì)FOXO3 CDS和3'UTR區(qū)域停止密碼子周?chē)鷐6A位點(diǎn)的識(shí)別，但YTHDF3不影響FOXO3 mRNA的穩(wěn)定性。

圖7 YTHDF3促進(jìn)FOXO3翻譯，但是不影響其mRNA的穩(wěn)定性

8、YTHDF3可能與eIF3a和eIF4B相互作用促進(jìn)FOXO3的翻譯

從免疫共沉淀（co-IP）LC-MS / MS數(shù)據(jù)中，作者注意到Y(jié)THDF3與多個(gè)翻譯起始因子共純化。eIF3a和eIF4B是營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)最顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)（圖8a-b）。對(duì)不同核糖體組分的WB分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)YTHDF3缺失時(shí)，eIF3a和eIF4B從較重的多聚體組分轉(zhuǎn)移到較輕的多聚體組分（圖8c），表明eIF3a和eIF4B可能在YTHDF3對(duì)翻譯的影響中發(fā)揮作用。silico docking分析顯示eIF3a、eIF4B和YTHDF3之間存在潛在的蛋白質(zhì)相互作用。

在對(duì)接能最低的對(duì)接模型（YTHDF3-eIF3a: - 1002.8; YTHDF3-eIF4B: - 834.7）中，以下殘基被定位在模型界面并負(fù)責(zé)相互作用：YTHDF3中的Y424、E426和T441以及eIF3a中的R476、R483和I484；YTHDF3中的Y424、T441和S470以及eIF4B中的S88、F99和Y141（圖8D）。co - IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正常和無(wú)營(yíng)養(yǎng)條件下，內(nèi)源性eIF3a和eIF4B與YTHDF3共沉淀；營(yíng)養(yǎng)饑餓可以同時(shí)增加沉淀的eIF3a、eIF4B和YTHDF3的數(shù)量。在YTHDF3 KD MEFs中，有少量蛋白沉淀（圖8e）。接下來(lái)，作者在裂解液中添加RNase A并沒(méi)有減少與YTHDF3分離的eIF3a和eIF4B的量，這表明這種相互作用是不依賴于RNA的（圖8f）。為確定eIF3a和eIF4B對(duì)FOXO3翻譯的影響，作者使用shRNA慢病毒敲低eIF3a或eIF4B（圖8g）。敲低這兩種蛋白中的任何一種都降低了FOXO3蛋白水平（圖8g），表明FOXO3的翻譯被削弱了。這些結(jié)果表明YTHDF3可能與eIF3a和eIF4B相互作用，促進(jìn)FOXO3的翻譯。Co-IP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了YTHDF3與PABP1或eIF4G2在MEFs中的相互作用。然而，這些相互作用在營(yíng)養(yǎng)饑餓后顯著減少（圖8h），而YTHDF3和eIF3a或eIF4B之間的相互作用增加（圖8e），表明YTHDF3和翻譯起始調(diào)節(jié)因子之間的相互作用在不同的細(xì)胞亞型和不同的細(xì)胞應(yīng)激條件下可能有很大的不同。

圖8 YTHDF3可能與eIF3a和eIF4B相互作用促進(jìn)FOXO3的翻譯

圖9 機(jī)制圖

結(jié)論

總的來(lái)說(shuō)，本研究揭示了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和自噬之間的重要聯(lián)系。作者提供了m6A閱讀器的證據(jù)YTHDF3作為一個(gè)營(yíng)養(yǎng)應(yīng)答器，結(jié)合m6A高甲基化，由METTL3安裝在FOXO3 mRNA的停止密碼子周?chē)?，然后YTHDF3募集eIF快速促進(jìn)FOXO3的翻譯，進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄上激活核心自噬基因的一部分，從而促進(jìn)自噬。

參考文獻(xiàn)

Hao W, Dian M, Zhou Y, Zhong Q, Pang W, Li Z, Zhao Y, Ma J, Lin X, Luo R, Li Y, Jia J, Shen H, Huang S, Dai G, Wang J, Sun Y, Xiao D. Autophagy induction promoted by m6A reader YTHDF3 through translation upregulation of FOXO3 mRNA. Nat Commun. 2022 Oct 4;13(1):5845. doi: 10.1038/s41467-022-32963-0.