基于單細(xì)胞RNA-seq和體RNA-seq數(shù)據(jù)的肝細(xì)胞癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的表征和基于CAF的風(fēng)險(xiǎn)特征構(gòu)建

癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)參與腫瘤生長、血管生成、轉(zhuǎn)移和治療抵抗。近日，有研究探索肝細(xì)胞癌(HCC)中CAFs的特征，并建立一個(gè)基于CAFs的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)簽，用于預(yù)測HCC患者的預(yù)后。該研究發(fā)表在《Frontiers in immunology》，IF：8.786。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 篩選scRNA-seq樣品中的CAFs

本研究的流程圖如圖1所示。初步篩選后，從scRNA-seq數(shù)據(jù)中共獲得69,145個(gè)細(xì)胞(表1)。圖2A為21個(gè)樣本分布的TSNE圖，生成了4個(gè)CAF聚類 (圖2B)。4個(gè)CAF簇中共鑒定出211個(gè)DEGs，其中排名前5位的DEGs(被確定為CAF簇的標(biāo)記基因)在4個(gè)簇中的表達(dá)如圖2C所示。每個(gè)隊(duì)列中4個(gè)集群的比例見圖2D。這些DEGs富集于多條通路，包括血管平滑肌收縮、黏著斑、催產(chǎn)素信號(hào)通路、PPARG信號(hào)通路等（圖2E）。此外，根據(jù)CNV特征，4個(gè)CAF簇由1533個(gè)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞組成(圖2F)。

圖1 本研究實(shí)驗(yàn)流程圖

表1樣品過濾前后的細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖2基于HCC患者scRNA-seq數(shù)據(jù)識(shí)別CAF集群

2. CAF中癌相關(guān)途徑的表達(dá)

不同CAF簇中10條腫瘤相關(guān)通路的GSVA評(píng)分如圖3A所示。CAF_0簇中的惡性細(xì)胞比例顯著高于其他三個(gè)簇(圖3B)。而CAF_1、CAF_2、CAF_3之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析每個(gè)CAF簇中惡性與非惡性細(xì)胞間10條腫瘤相關(guān)通路的GSVA評(píng)分，發(fā)現(xiàn)有輕微差異(圖3C-F)。為了確定CAF集群和預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，首先基于TCGA隊(duì)列計(jì)算了每個(gè)CAF集群的標(biāo)記基因(圖2C中定義的CAF集群的前5個(gè)DEGs)的ssGSEA評(píng)分。結(jié)果表明，CAF_2簇在腫瘤樣本中的評(píng)分顯著高于正常樣本，而其他CAF簇的趨勢相反，正常樣本中的評(píng)分高于腫瘤樣本(圖4A)。根據(jù)survminer R包分析的最佳截?cái)嘀祵?/span>TCGA數(shù)據(jù)集的HCC樣本分為高CAF評(píng)分組和低CAF評(píng)分組。高CAF評(píng)分組樣本在CAF_0、CAF_1和CAF_2簇中的預(yù)后優(yōu)于低CAF評(píng)分組樣本，而CAF_3與HCC的預(yù)后無關(guān)(圖4B-E)。上述結(jié)果表明，盡管肝癌和正常樣本的CAF_3富集不同，但CAF_3簇可能在肝癌進(jìn)展中作用不大。

圖3 CAF簇中腫瘤相關(guān)通路的特征

圖4 4種CAF聚類與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

3. 與CAF相關(guān)的關(guān)鍵基因的鑒定

為了構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)簽，首先在腫瘤和正常組織之間篩選出DEGs。如圖5A所示，共獲得2349個(gè)DEGs，其中462個(gè)上調(diào)，1887個(gè)下調(diào)。其中，有423個(gè)基因與這些預(yù)后相關(guān)的CAF集群顯著相關(guān)。進(jìn)一步通過單因素Cox回歸分析評(píng)估每個(gè)基因的預(yù)后價(jià)值，有234個(gè)基因具有預(yù)后價(jià)值(圖5A, B)。Lasso Cox回歸分析縮小基因數(shù)量，剩下11個(gè)基因lambda=0.047(圖5C, D)。采用逐步回歸法進(jìn)行多因素Cox回歸分析后，最終納入6個(gè)基因 (圖5E)。根據(jù)每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。在TCGA隊(duì)列和GEO隊(duì)列中，1 ~ 5年生存率模型的AUC值范圍分別為0.68 ~ 0.76和0.65 ~ 0.7(圖5F, G)。Kaplan-Meier生存分析顯示，高危患者的生存結(jié)局顯著劣于低?；颊?/span>(圖5H, I)。

圖5確定用于構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)簽的核心預(yù)測基因

4. 關(guān)鍵基因突變及通路分析

檢測該風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)簽的6個(gè)基因的SNV突變情況。結(jié)果顯示，ADAMTSL2、SLCO2A1、HMGXB3、LUC7L3和CD4在更多的樣本中有SNV突變并均無顯著的共現(xiàn)概率，而GCN1中未觀察到SNV突變，且在這6個(gè)基因中只有非常少的樣本有CNV的獲得/丟失(圖S4A-C)。此外，SLCO2A1與非整倍體評(píng)分、同源重組缺陷、改變的部分、節(jié)段數(shù)量和非沉默突變率呈顯著負(fù)相關(guān)，而HMGXB3、LUC7L3和GCN1與同源重組缺陷和改變的部分呈顯著正相關(guān)(圖S4D)。接下來，還分析了與每個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因相關(guān)的潛在通路，與這6個(gè)基因顯著相關(guān)的通路共有39條，包括血管生成、頂端連接、凋亡等（圖6A和B）。

圖S4風(fēng)險(xiǎn)特征中包含的基因突變的特征

圖6識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)基因參與的通路

5. 核心基因與免疫的關(guān)系

ADAMTSL2、SLCO2A1和CD4與間質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和估計(jì)值呈顯著正相關(guān)，而LUC7L3與間質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和估計(jì)值呈顯著負(fù)相關(guān)。然而，三種評(píng)分與其他基因(GCN1和HMGXB3)之間沒有觀察到顯著的相關(guān)性(圖S5A)。根據(jù)各基因表達(dá)量的中位數(shù)分組后，比較不同表達(dá)組的3個(gè)評(píng)分。結(jié)果顯示，對(duì)于ADAMTSL2、SLCO2A1和CD4基因，高表達(dá)組的三個(gè)評(píng)分均顯著高于低表達(dá)組(圖S5B)。相關(guān)性分析顯示ADAMTSL2、SLCO2A1、CD4與大部分T細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，LUC7L3、GCN1和HMGXB3與M0巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈顯著正相關(guān)(圖S5C)。幾種免疫細(xì)胞中風(fēng)險(xiǎn)基因的高表達(dá)組和低表達(dá)組之間存在顯著差異(圖S5D)。

圖S5風(fēng)險(xiǎn)基因與免疫景觀的關(guān)系

6. 風(fēng)險(xiǎn)特征對(duì)PD-L1阻斷免疫治療的反應(yīng)性

T細(xì)胞免疫療法已成為一種具有協(xié)同生存獲益的抗癌療法。IMvigor210隊(duì)列中的348例患者對(duì)抗PD- l1受體阻滯劑表現(xiàn)出不同程度的緩解，包括完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)。SD/PD患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高于CR/PR患者(圖7A)。在高危組中，SD/PD百分比高于低危組(圖7B)。在IMvigor210隊(duì)列中，與高危組患者相比，低危組患者顯示出顯著的臨床獲益和顯著較長的總生存期(圖7C, p=0.0053)。具體來說，I+II期患者在不同風(fēng)險(xiǎn)組之間有顯著的生存差異(圖7D, p=0.0017)，但在III+IV期患者中無顯著差異(圖7E, p=0.5)，提示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在早期患者中更敏感。在GSE78220隊(duì)列中，還發(fā)現(xiàn)低危組患者的總生存期顯著長于高危組(圖7F, p=0.036)，高危組的SD/PD百分比高于低危組(圖7G)。

圖7 IMvigor210隊(duì)列中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)PD-L1阻斷免疫治療的反應(yīng)性

8. 確定獨(dú)立危險(xiǎn)因素并繪制列線圖

多因素分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)簽是影響骨肉瘤患者預(yù)后的最重要的獨(dú)立因素，其次是轉(zhuǎn)移狀態(tài) (圖8A、B)。因此，構(gòu)建了聯(lián)合分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的列線圖（圖8C）。校準(zhǔn)圖顯示，列線圖可以有效預(yù)測實(shí)際生存結(jié)局(圖8D)。此外，DCA顯示列線圖對(duì)高?；颊叩淖R(shí)別能力優(yōu)于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和分期（圖8E）。TimeROC分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和列線圖的AUC高于TCGA隊(duì)列中的其他指標(biāo)(圖8F)。

圖8建立預(yù)測肝癌預(yù)后列線圖

結(jié)論：

綜上所述，該研究系統(tǒng)地描述了HCC中CAF群體的特征，并產(chǎn)生了4個(gè)具有顯著多樣性的CAF集群。4個(gè)聚類之間的DEGs富集在血管平滑肌收縮、黏著斑、催產(chǎn)素和PPARG信號(hào)通路等。其中3個(gè)基因簇與HCC預(yù)后顯著相關(guān)，并用于構(gòu)建一個(gè)基于6個(gè)基因的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)簽。作者觀察到基于CAF的基因標(biāo)簽與免疫景觀相關(guān)，可以用于預(yù)測對(duì)PD-L1阻斷免疫治療的反應(yīng)性。最后，基于風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)簽和臨床病理特征建立了一種新的列線圖模型，該模型對(duì)HCC患者的臨床結(jié)局具有良好的預(yù)測性能。