BMP4通過Ube2s和Chmp4b介導(dǎo)的染色體穩(wěn)定性保護(hù)mESCs的發(fā)育潛力

化學(xué)定義培養(yǎng)基被廣泛用于培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)，其中N2B27作為血清的替代品，GSK3β和MEK抑制劑(2i)有助于促進(jìn)基態(tài)多能性。最近的研究表明，MEKi可能導(dǎo)致不可逆的缺陷，損害了mESCs的發(fā)育潛力。我們證明了在化學(xué)條件下骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號的缺乏是多能性受損的主要原因之一。機(jī)制上，BMP4激活BMP信號通路可通過調(diào)控下游靶點(diǎn)Ube2s和Chmp4b來維護(hù)mESCs的染色體完整性和增殖能力。BMP4具有明顯的體內(nèi)發(fā)育潛力和長期的多能性保存。BMP4驅(qū)動(dòng)的多能性改善優(yōu)于減弱MEK抑制。綜上所述，我們的研究表明BMP信號的適當(dāng)激活在調(diào)節(jié)功能多能性方面是必不可少的，揭示了BMP4應(yīng)應(yīng)用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)。本文于2022年8月發(fā)表于Protein & Cell (IF=15.328)上

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

(1) 與S/2i-mESC相比，N/2i-mESCs具有有限的多能性

我們首先從攜帶Oct4-ΔPE-EGFP (OG2)報(bào)告子的囊胚中衍生出傳統(tǒng)血清條件下的mESC系。本研究的株系具有正常核型和高效力(圖1A-D)。將三個(gè)細(xì)胞系分別適應(yīng)S/2i和N/2i條件15天，并與S條件下相同傳代后的原細(xì)胞系進(jìn)行比較(圖1A)。在三種條件下培養(yǎng)的mESCs都表現(xiàn)出緊密填充和圓頂?shù)木洌@示出顯著的Oct4-EGFP的一致維持(圖1B)。然而，N/2i-mESCs的菌落形態(tài)明顯變小，表明增殖能力受損(圖1B)。這些N/2i-mESC表現(xiàn)出嚴(yán)重的非整倍性，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而惡化(圖1C)。相比之下，在S/2i-mESCs中未發(fā)現(xiàn)這些異常，提示無血清條件下缺乏的一些因素可能是導(dǎo)致這些缺陷的原因。與相應(yīng)的S-mESCs相比，所有S/2i-mESCs在皮膚和種系中的嵌合性顯著增強(qiáng)(圖1D-F)。四倍體胚胎互補(bǔ)(TEC)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，N/2i-mESCs在體內(nèi)的發(fā)育嚴(yán)重受損，因?yàn)闊o法產(chǎn)生全ESC小鼠(圖1G)。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)S/2i-mESCs具有非常好的發(fā)育潛力，而在N/2i條件下，由2i驅(qū)動(dòng)的功能改善被削弱，N/2i-mESCs表現(xiàn)出染色體不穩(wěn)定、增殖紊亂和發(fā)育潛力受限。

圖1：與N/2i-mESCs相比，S/2i-mESCs具有更好的發(fā)育潛力。

(2) N/2i條件下失活的TGFβ、BMP、AKT信號通路在S/2i條件下得到改善

為了揭示N/2i-mESCs與S/2i-mESCs相比發(fā)育潛力受限的潛在分子機(jī)制，我們進(jìn)行了RNA測序。主成分分析(PCA)表明N/2imESCs的轉(zhuǎn)錄組與S/2i-mESCs的轉(zhuǎn)錄組有很大的不同(圖2A)。差異表達(dá)基因(DEGs)分析顯示，男性N/2i-mESCs與男性S/2i-mESCs相比，有3233個(gè)基因發(fā)生顯著變化(圖2B)。干細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、干細(xì)胞維持和胚胎發(fā)育等過程主要在N/2i-mESCs中被下調(diào)，說明N/2i-和S/2i-mESCs在許多方面是不同的(圖2C)。我們對多個(gè)關(guān)鍵信號通路進(jìn)行了基因集富集分析(GSEA)(圖2D)。通過基因本體論分析，我們分析了兩性S/2i mESCs中特異上調(diào)的1581個(gè)基因(圖2E)，發(fā)現(xiàn)TGFβ和PI3K-Akt信號通路明顯富集(圖2F)。通過motif調(diào)用分析發(fā)現(xiàn)，這些上調(diào)的基因中有許多是Klf和Smad家族成員的靶點(diǎn)(圖2G)。上述三個(gè)信號通路的代表性基因的表達(dá)確實(shí)在N/2i-mESCs中下調(diào)，在S/2imESCs中恢復(fù)(圖2H)。綜合來看，N/2i-mESCs中tgf-β、BMP和AKT信號通路被滅活。作為對比，這些通路在S/2i-mESCs中被恢復(fù)，這可能是觀察到的發(fā)育改善的原因(圖1D-G)。

圖2：S/2i條件下TGFβ、BMP、AKT信號通路的失活得到改善。

(3) BMP4保護(hù)了染色體的完整性，并保留了mESCs的發(fā)育潛力

我們對已被證明可分別激活TGFβ、BMP或AKT信號通路的生長因子進(jìn)行了小范圍篩選。將mESC在添加特異性生長因子的N/2i條件下培養(yǎng)15天，用于分析和比較(圖3A)。BMP4的效果最好，其次是BMP7和BMP2，說明在N/2i條件下，BMP信號通路對維持染色體完整性至關(guān)重要(圖3B)。BMP信號的重新激活可以進(jìn)一步恢復(fù)N/2i-mESCs的增殖能力；受損的細(xì)胞周期得到恢復(fù)，停留在G1期的細(xì)胞減少，細(xì)胞周期持續(xù)時(shí)間縮短(補(bǔ)充圖未展示)。我們隨后研究了BMP信號的激活是否能從功能上提高N/2i-mESCs的發(fā)育潛力。在N/2i mESCs中添加BMP4可顯著提高皮膚中的嵌合率180%(圖3C,E)和種系中的嵌合率150%(圖3D,E)。這種改善在所有測試的mESC系中都是一致的(圖3F,G)。隨著BMP4的補(bǔ)充，異常高的N/2i-mESCs的吸收率顯著降低(補(bǔ)充圖未展示)。最后，我們進(jìn)行了TEC試驗(yàn)，以測試這些mESC的自主發(fā)育潛力。與N/2i-mESC形成對比，N/2i+BMP-mESC可以有效地生成活的all-ESC小鼠(圖3H)。綜上所述，BMP4的激活可以保留mESCs的發(fā)育潛力，并維護(hù)其染色體完整性。

圖3：BMP4保護(hù)了染色體的完整性，并保留了mESCs的發(fā)育潛力。

(4) Ube2s和Chmp4b對BMP4介導(dǎo)的染色體完整性維護(hù)和多能性維護(hù)至關(guān)重要

N/2imESCs中相對于S/2i-mESCs中失調(diào)的染色體分離和細(xì)胞周期的相關(guān)基因可能是BMP信號通路的潛在下游靶點(diǎn)(圖4A,B)。Timp2等5個(gè)基因僅在N/2i-mESCs中異常表達(dá)，補(bǔ)充BMP4可以恢復(fù)這些基因，其中Ube2s和Chmp4b最為明顯(圖4C)。Ube2s和Chmp4b與調(diào)控染色體分離和細(xì)胞周期密切相關(guān)(圖4A,B)。我們通過shRNA介導(dǎo)的基因敲除在N/2i+BMP4條件下生成Ube2s-和Chmp4b缺陷的mESCs，并通過免疫印跡和RT-qPCR分析驗(yàn)證這些基因的敲除(圖4D)。shUbe2s- or shChmp4b-mESCs表現(xiàn)出嚴(yán)重的非整倍性和DNA損傷。這些缺陷在含有BMP4的條件下不能被修復(fù)，表明Ube2s和Chmp4b是BMP4的關(guān)鍵靶點(diǎn)(圖4E,F)。ishUbe2s-或ishChmp4b-mESCs產(chǎn)生的畸胎瘤比對照mESCs產(chǎn)生的畸胎瘤小得多(圖4G)，說明這些mESCs的增殖受到嚴(yán)重?fù)p害。與具有明顯三種層分化細(xì)胞的對照組畸胎瘤相比，這些微小的畸胎瘤分化較差(圖4G)，說明Ube2s或Chmp4b的短期敲除足以引起非整倍體，從而進(jìn)一步破壞mESCs的分化能力(圖4E)。在嵌合試驗(yàn)中應(yīng)用ishUbe2s-mESCs或ishChmp4b-mESCs作為供體細(xì)胞后，只能獲得少量嵌合胚胎，并且這些胚胎在皮膚和性腺中分別呈現(xiàn)出較低的mCherry+和Oct4-EGFP+細(xì)胞比例(圖4H,I)。我們生成了Ube2s-和Chmp4b過表達(dá)的N/2i-mESC并進(jìn)行了分析(圖4J)。這兩種細(xì)胞系在N/2i條件下表現(xiàn)出較高的整倍體細(xì)胞比例和恢復(fù)的增殖能力(圖4K)。Ube2s過表達(dá)的N/2i-mESCs在體內(nèi)發(fā)育潛力增強(qiáng)，吸收速率降低，而Chmp4b過表達(dá)的影響相對適中(圖4L,M)。綜上所述，Ube2s和Chmp4b是BMP4的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，它們對BMP4介導(dǎo)的染色體完整性保護(hù)，正常增殖能力和發(fā)育潛能的維持至關(guān)重要。

圖4：Ube2s和Chmp4b對BMP4介導(dǎo)的染色體完整性和多能性維護(hù)至關(guān)重要。

(5) BMP4可恢復(fù)N/2i-mESCs的轉(zhuǎn)錄組失調(diào)，并長期保持其多能性

我們發(fā)現(xiàn)N/2i+BMP4條件可以在較長培養(yǎng)時(shí)間下保持mESCs的發(fā)育潛力。N/2i+BMP-mESC在培養(yǎng)55天后產(chǎn)生的嵌合胚的嵌合率甚至高于僅培養(yǎng)15天的N/2i-mESC(圖5A)。這種多能性保存對mESC的種系傳遞能力非常重要，因?yàn)殚L時(shí)間培養(yǎng)的N/2i-mESC產(chǎn)生的嵌合胚胎幾乎失去了性腺中的Oct4-EGFP信號(圖5A)。我們通過RNA-Seq分析BMP4對轉(zhuǎn)錄組的影響。PCA和分層聚類圖表明，N/2i+BMP4-mESCs的轉(zhuǎn)錄組與N/2i-mESCs的轉(zhuǎn)錄組差異很大，與血清條件下的轉(zhuǎn)錄組(S-和S/2imESCs)相似(圖5B)。許多在N/2i-mESCs中異常下調(diào)的多能性關(guān)鍵基因只有在BMP4補(bǔ)充的條件下才能成功恢復(fù)(圖2C)。DEG分析進(jìn)一步顯示，在N/2i條件下，受BMP4影響的1975個(gè)顯著變化基因中，有1633個(gè)基因上調(diào)(圖5C)。1633個(gè)上調(diào)基因的KEGG通路上的基因本論顯示，TGFβ和PI3K-Akt信號通路明顯富集，通過motif調(diào)用分析，這些基因中有許多是Klf和Smad家族成員的下游靶點(diǎn)(圖5D,E)。這一發(fā)現(xiàn)與在S/2i-mESCs和N/2i-mESCs中的結(jié)果相似(圖2F,G)，進(jìn)一步證實(shí)了BMP4在血清系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用。GSEA研究表明，N/2i-mESCs中受損的tgf-β、BMP和AKT信號通路在BMP4補(bǔ)充后顯著恢復(fù)(圖2D,5F)。綜上所述，BMP4在化學(xué)定義的條件下很大程度上恢復(fù)了關(guān)鍵基因和信號通路的失調(diào)，并可以在長期培養(yǎng)中維持mESCs的增強(qiáng)發(fā)育潛能。

圖5：BMP4可恢復(fù)N/2i-mESCs的轉(zhuǎn)錄組失調(diào)，并長期保持其多能性。

(6) 與N/a2i-和N/t2i-mESCs相比，N/2i+BMP4-mESCs表現(xiàn)出明顯的多能性特征

N/2i+BMP4-mESCs比N/2imESCs具有更強(qiáng)的發(fā)育潛力。將mESC系#S2分別適應(yīng)N/2i+BMP4、N/a2i和N/t2i條件15天。在這三種無血清條件下培養(yǎng)的適應(yīng)的mESCs均表現(xiàn)出一致的Oct4-EGFP維持。與N/a2i-mESCs或N/t2i-mESCs相比，N/2i+BMP4-mESCs在體內(nèi)發(fā)育潛力最高(圖6A,B)。免疫印跡和ELISA表明，BMP4幾乎不影響ERK1/2的磷酸化(圖6C,D)。全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)表明BMP4對DNA甲基化恢復(fù)沒有影響。S/2i、N/2i和N/2i+BMP4均導(dǎo)致mESCs中明顯的全基因組低甲基化，而減弱MEK的抑制則維持親本差異甲基化區(qū)域(DMRs)(圖6E)。印跡控制區(qū)域(ICRs)甲基化在15天的培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)換后，所有組均未顯示出很大的變化(圖6F)。為了進(jìn)一步了解N/2i+BMP4-、N/a2i-和N/tt2i-mESCs之間的轉(zhuǎn)錄差異，我們進(jìn)行了RNA-seq分析。與N/2i+BMP4相比，N/a2i或N/t2i引起的基因表達(dá)變化相對溫和(圖5C)。N/2i-、N/a2i-和N/tt2i-mESCs表現(xiàn)出非常相似的轉(zhuǎn)錄組和相對不活躍的全局轉(zhuǎn)錄水平，這與N/2i+BMP-mESCs不同(圖5B,6G,H)。減弱MEK的抑制并不能恢復(fù)mESCs中受損的tgf-β、BMP和AKT信號通路(圖5F,6I,J)。綜上所述，與N/a2i-和N/tt2i-mESCs相比，N/2i+BMP4-mESCs表現(xiàn)出更好的多能性，我們推薦在無血清體系下，N/2i+BMP4條件下mESCs的質(zhì)量最好。

圖6：與N/a2i-和N/t2i-mESCs相比，N/2i+BMP4-mESCs表現(xiàn)出明顯的多能性特征。

結(jié)論：綜上所述，BMP4在無血清條件下維持mESCs染色體完整性和多能性方面具有不可替代的作用。不斷改進(jìn)培養(yǎng)條件的組成部分將有助于增強(qiáng)多能性的維持，并對多能性調(diào)控有更多的了解，更重要的是，如何在基礎(chǔ)研究和再生醫(yī)學(xué)中進(jìn)一步利用這一特性。

參考文獻(xiàn)：

Wang, M., Zhao, K., Liu, M., Wang, M., Qiao, Z., Yi, S., Jiang, Y., Kou, X., Zhao, Y., Yin, J., Li, T., Wang, H., Jiang, C., Gao, S., & Chen, J. (2022). BMP4 preserves the developmental potential of mESCs through Ube2s- and Chmp4b-mediated chromosomal stability safeguarding. Protein & cell, 13(8), 580–601. https://doi.org/10.1007/s13238-021-00896-x.