長(zhǎng)鏈非編碼RNA TLNC1通過(guò)抑制p53信號(hào)促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

肝癌是全球第六大常見(jiàn)惡性腫瘤和第三大癌癥死亡原因。肝癌的高死亡率已被認(rèn)為是由轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)直接引起的。然而，目前臨床上可用于預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的方法非常有限。為了更有效地治療肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，研究肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義。該研究發(fā)表于《Molecular Cancer》，IF: 41.444。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. TLNC1在肝癌組織中高表達(dá)并與患者預(yù)后相關(guān)

為了找到與肝癌的發(fā)展和進(jìn)展相關(guān)的lncRNA，作者對(duì)11對(duì)肝癌和鄰近的正常肝組織進(jìn)行了RNA-seq，并確定了328個(gè)顯著改變的lncRNA（圖1a）。為了縮小候選lncRNA的范圍，作者首先利用了TCGA LIHC隊(duì)列（50對(duì)）的RNA-seq數(shù)據(jù)，并確定了658個(gè)顯著改變的lncRNA（圖1b）。通過(guò)WCH 和TCGA隊(duì)列的交叉，確定了101個(gè)顯著改變的lncRNA，隨后根據(jù)TCGA LIHC隊(duì)列的總生存期 (OS) 和無(wú)病生存期(DFS)數(shù)據(jù)對(duì)其進(jìn)行生存分析。經(jīng)過(guò)生存分析，作者成功鑒定出5個(gè)候選lncRNA，它們?cè)谀[瘤和正常組織之間存在顯著差異表達(dá)，并且與肝癌患者的OS和DFS均顯著相關(guān)（圖1c）。接下來(lái)，通過(guò)qRT-PCR對(duì)20對(duì)組織樣本驗(yàn)證了這些候選lncRNA的表達(dá)水平。基于表達(dá)水平數(shù)據(jù)，TLNC1被選為候選lncRNA進(jìn)行進(jìn)一步研究，因?yàn)樗巧鲜?/span>5個(gè)候選lncRNA中最豐富的lncRNA（圖1d)。此外，作者擴(kuò)大了樣本量（n=72）以確認(rèn)TLNC1在肝癌組織中顯著高表達(dá)（圖1e)。一致地，在TCGA LIHC隊(duì)列中也觀察到了類似的結(jié)果（圖1f, g)。這些發(fā)現(xiàn)表明TLNC1是一種豐富的lncRNA，在肝癌中顯著上調(diào)并與患者預(yù)后相關(guān)。

圖1 TLNC1在肝癌組織中上調(diào)

2. TLNC1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)體外和體內(nèi)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

為了確定TLNC1是否作為致瘤性lncRNA發(fā)揮作用，作者構(gòu)建了兩個(gè)TLNC1過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞系SNU449和HCCLM3細(xì)胞（圖2a）。CCK-8和EdU測(cè)定顯示TLNC1的過(guò)表達(dá)顯著提高了SNU449和HCCLM3細(xì)胞的細(xì)胞增殖（圖2b, c)。此外，作者證明與指定的對(duì)照相比，TLNC1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加（圖2d-g）。為了在體內(nèi)驗(yàn)證TLNC1的致癌功能，作者首先構(gòu)建了皮下異種移植肝癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)TLNC1的強(qiáng)制表達(dá)顯著增加了異種移植腫瘤的體積和重量（圖2h）。此外，建立肝原位移植模型和肺轉(zhuǎn)移模型，以評(píng)估TLNC1過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）成像結(jié)果表明，TLNC1過(guò)表達(dá)組在肝臟中表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度。同時(shí)，TLNC1的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的肝臟定植（圖2i）。一致地，TLNC1-過(guò)表達(dá)組在肺轉(zhuǎn)移模型中顯示出更多的肺轉(zhuǎn)移灶（圖2j)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明TLNC1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了肝癌的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

圖2 TLNC1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

3. TLNC1對(duì)肝癌的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要

為了證實(shí)TLNC1在肝癌腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的功能，作者在SNU449和HCCLM3細(xì)胞中使用3個(gè)獨(dú)立的短發(fā)夾RNA (shRNA) 使TLNC1沉默（圖3a）并選擇2個(gè)具有更好敲低功效的shRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，TLNC1的沉默抑制了SNU449和HCCLM3細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)（圖3b, c)。同時(shí)，與指定的對(duì)照相比，TLNC1敲低的肝癌細(xì)胞系中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性顯著下調(diào)（圖3d-f)。為了確定TLNC1是否是體內(nèi)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移所必需的，作者首先構(gòu)建了皮下異種移植肝癌小鼠模型，并表明TLNC1的沉默降低了異種移植腫瘤的體積和重量（圖3g）。此外，肝原位移植模型和肺轉(zhuǎn)移模型被用來(lái)驗(yàn)證TLNC1沉默對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。IVIS成像結(jié)果表明TLNC1敲低組在肝臟中顯示出較弱的生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度。同時(shí)，TLNC1的敲低顯著抑制肝癌細(xì)胞的肝臟定植（圖3h）。一致地，TLNC1敲低組在肺轉(zhuǎn)移模型中顯示出較少的肺轉(zhuǎn)移灶（圖3i）?？傊?，作者的結(jié)果表明TLNC1是肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移所必需的。

圖3 TLNC1的敲低抑制了肝癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

4. TLNC1調(diào)節(jié)與細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的多種信號(hào)通路

為了探索TLNC1介導(dǎo)的肝癌腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了RNA-seq以鑒定受TLNC1敲低調(diào)節(jié)的基因，并?在與對(duì)照相比，TLNC1敲低的HCCLM3細(xì)胞（圖4a）。京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析表明，p53信號(hào)通路和細(xì)胞周期是最顯著的富集通路之一?；虮倔w論（GO）分析表明，TLNC1可以調(diào)節(jié)一系列與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞粘附、粘著斑和有絲分裂細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)（圖4b）。之后，分別在p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期和粘著斑基因組中鑒定出倍數(shù)變化最顯著的前10個(gè)基因（圖4c）。為了驗(yàn)證RNA-seq的數(shù)據(jù)，作者使用qRT-PCR檢查了每個(gè)基因組中5個(gè)基因的mRNA水平。如圖4d和e所示，TLNC1的調(diào)節(jié)確實(shí)調(diào)節(jié)了與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的表達(dá)水平。

圖4 TLNC1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中參與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的基因的失調(diào)

5. TLNC1與TPR相互作用調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路

為了進(jìn)一步了解TLNC1調(diào)節(jié)的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制，作者隨后使用生物素標(biāo)記的RNA pull-down和質(zhì)譜 (MS) 來(lái)鑒定與肝癌細(xì)胞中TLNC1相互作用的蛋白質(zhì)。由于作者已經(jīng)證明TLNC1主要定位于細(xì)胞核，作者只提取核蛋白用于RNA pull-down。共有393種蛋白質(zhì)被鑒定為TLNC1相互作用蛋白。基于RNA-seq和MS數(shù)據(jù)的交集，作者假設(shè)TLNC1可能通過(guò)與TPR相互作用來(lái)調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先驗(yàn)證了TLNC1和TPR之間的相互作用。

接下來(lái)，作者試圖確定TLNC1和TPR之間的相互作用位點(diǎn)。根據(jù)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件RNAfold，作者提出了3個(gè)可能與TPR相互作用的潛在部分?；陬A(yù)測(cè)，作者構(gòu)建了3個(gè)截短的TLNC1片段，并表明TLNC1和TPR之間的相互作用需要1-653個(gè)核苷酸（圖5a）。之后，作者進(jìn)行了RNA pull-down和RIP分析，以表明TPR的775-1700個(gè)氨基酸是TPR與TLNC1相互作用的原因（圖5b, c)。

為了確定TLNC1是否能夠調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路，作者使用含有p21啟動(dòng)子的載體進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，p21啟動(dòng)子是眾所周知的p53轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)。結(jié)果表明TLNC1 過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)p53在肝癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性（圖5d)。一致地，p53靶基因的mRNA水平，如 p21、波形蛋白、MMP2、Bax 和 Maspin，可以被TLNC1調(diào)節(jié)（圖5e)。為了進(jìn)一步確定TLNC1通過(guò)TPR調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路，作者在TLNC1過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞中用siRNA敲低TPR（圖5f）。如圖5g-i所示，TPR的敲低阻斷了TLNC1過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的p21下調(diào)，以及TLNC1的致瘤功能。

這些結(jié)果表明TLNC1可以通過(guò)與TPR相互作用來(lái)調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路。

圖5 TLNC1與TPR相互作用并抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性

6. TLNC1通過(guò)與TPR相互作用促進(jìn)p53胞質(zhì)易位

為了發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，p53必須從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。為了了解TLNC1如何調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路的機(jī)制，作者檢測(cè)了p53在TLNC1過(guò)表達(dá)或敲低時(shí)的亞細(xì)胞定位。如圖6a所示，TLNC1過(guò)表達(dá)極大地刺激了p53的細(xì)胞質(zhì)易位。免疫印跡進(jìn)一步證實(shí)了這一觀察結(jié)果，盡管p53的總蛋白水平在TLNC1過(guò)表達(dá)后保持不變，但細(xì)胞核中p53的量顯著降低（圖6b, c)。

根據(jù)以往的研究，TPR可以與染色體維持區(qū)1 (CRM1) 形成復(fù)合物，介導(dǎo)p53的核輸出。為了確定TLNC1是否通過(guò)調(diào)節(jié)TPR-CRM1-p53復(fù)合物促進(jìn)p53的核輸出，作者檢查了TPR、CRM1和p53與co-IP之間的相互作用。如圖6d所示，TPR可以與野生型肝癌細(xì)胞中的CRM1和p53相互作用。有趣的是，TLNC1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了TPR-CRM1-p53復(fù)合物的相互作用，而TLNC1的敲低抑制了TPR-CRM1-p53復(fù)合物的相互作用（圖6e)。為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TLNC1如何促進(jìn)復(fù)合物的形成，作者首先檢查了蛋白質(zhì)與純化重組蛋白的相互作用，以排除細(xì)胞裂解物中其他蛋白質(zhì)的干擾。如圖6f所示，TPR顯示直接與CRM1結(jié)合，CRM1可以直接與p53結(jié)合；然而，TPR不能直接與p53結(jié)合。接下來(lái)，表面等離子共振分析顯示，在存在 TLNC1 的情況下，TPR和CRM1之間的親和力顯著增加（圖6g）。

這些數(shù)據(jù)表明TLNC1通過(guò)與TPR的相互作用誘導(dǎo)p53的核輸出并上調(diào)TPR和CRM1 之間的親和力。

圖6 TLNC1通過(guò)與TPR的相互作用抑制p53的核轉(zhuǎn)位

7. TLNC1的上調(diào)預(yù)測(cè)肝癌患者的不良生存率

為進(jìn)一步探討TLNC1在肝癌中表達(dá)的臨床意義，將72例肝癌患者根據(jù)TLNC1的表達(dá)水平分為2組：TLNC1高表達(dá)組（n=36）和TLNC1低表達(dá)組（n=36）。相關(guān)分析顯示，TLNC1 表達(dá)與肝硬化顯著相關(guān)（p= 0.026）。單變量分析顯示，TLNC1高表達(dá)組的OS（風(fēng)險(xiǎn)比（HR），2.28；95%置信區(qū)間（CI），0.92～5.63）和TLNC1高表達(dá)組的DFS（HR，1.06；95%CI，0.59至1.93）比低 TLNC1 表達(dá)組差（p<0.05）。同樣，華西醫(yī)院（WCH）和TCGA 數(shù)據(jù)集的生存曲線顯示TLNC1表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（圖7a-d）。

為了驗(yàn)證TLNC1可以調(diào)節(jié)人肝癌中p53信號(hào)通路，作者檢測(cè)了p21 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)p21的mRNA水平與TLNC1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=- 0.6249，p<0.0001）。這些數(shù)據(jù)證明TLNC1可以誘導(dǎo)p53的核輸出并抑制p21的轉(zhuǎn)錄。為了評(píng)估TLNC1-p53軸的臨床潛力，作者隨后分析了TLNC1和p21組合的預(yù)后潛力。引人注目的是，TLNC1低表達(dá)和p21高表達(dá)的患者預(yù)后最好。相反，TLNC1高表達(dá)而p21低表達(dá)的患者預(yù)后最差（圖7e, f)。總之，這些數(shù)據(jù)表明TLNC1和p21的組合可用作肝癌患者的預(yù)后因素。

圖7 高水平的TLNC1與低水平的p21與肝癌患者預(yù)后不良有關(guān)

結(jié)論：

該研究表明，TLNC1能夠在體外和體內(nèi)促進(jìn)肝癌的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。機(jī)制上，該研究證明TLNC1可以與TPR相互作用以加強(qiáng)TPR和CRM1之間的相互作用，從而促進(jìn)p53的核輸出，導(dǎo)致一系列腫瘤抑制基因的下調(diào)和許多癌基因的上調(diào)，最終有助于誘導(dǎo)肝癌的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，該研究證明TLNC1與肝癌患者的OS和DFS密切相關(guān)，TLNC1和p53 靶基因p21的組合可以作為肝癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：

Yuan K, Lan J, Xu L, Feng X, Liao H, Xie K, Wu H, Zeng Y. Long noncoding RNA TLNC1 promotes the growth and metastasis of liver cancer via inhibition of p53 signaling. Mol Cancer. 2022;21(1):105. doi: 10.1186/s12943-022-01578-w.