非經(jīng)典維生素K循環(huán)可有效抑制鐵死亡

鐵死亡是一種以鐵依賴性脂質(zhì)過氧化為標(biāo)志的非凋亡性細(xì)胞死亡形式，在器官損傷、退行性疾病和耐藥性癌癥的易感性中起關(guān)鍵作用。盡管在理解與鐵死亡相關(guān)的分子過程方面取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但決定細(xì)胞對鐵死亡敏感性的其他細(xì)胞外在和細(xì)胞內(nèi)在過程仍然未知。

細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出許多高效的氧化還原系統(tǒng)來抵消不受控制的脂質(zhì)過氧化，例如硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶-4（GPX4），F(xiàn)SP1-泛醌途徑和生物蝶呤-二氫葉酸還原酶系統(tǒng)。此外，細(xì)胞和組織利用維生素E（包括生育酚和生育三烯酚），自然界中首屈一指的親脂性自由基捕獲抗氧化劑，以避免嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。維生素E還被證明可以可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞等免受關(guān)鍵鐵死亡調(diào)節(jié)因子 GPX4的組織特異性破壞引起的有害后果。

Nature雜志上發(fā)表了一篇題為 A non-canonical vitamin K cycle is a potent ferroptosis suppressor 的文章，該文章表明維生素K的完全還原形式除了作為γ-谷氨酰羧化酶的輔助因子參與凝血相關(guān)的常規(guī)功能外，還具有很強(qiáng)的抗鐵死亡功能。

維生素K是一種有效的抗鐵死亡化合物

為了探尋除了上述內(nèi)在和外在機(jī)制之外，是否還有其他系統(tǒng)可以有效預(yù)防鐵死亡，我們系統(tǒng)地研究了三苯氧胺（TAM）誘導(dǎo)Gpx4缺失的小鼠胚胎成纖維（Pfa1）細(xì)胞中一些天然維生素化合物抗鐵死亡作用。除了維生素E的活性形式之外（α-生育酚，α-TOH），只有維生素 K 的三種形式，葉綠醌（PK）、甲萘醌-4 （MK4）和甲萘醌（Menad）可以抑制Gpx4缺失誘導(dǎo)的鐵死亡。PK主要從綠葉蔬菜中獲得，可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為MK4，而Menad是一種合成變體。維生素K的抗鐵死亡活性不僅限于小鼠成纖維細(xì)胞，還可以防止缺乏GPX4表達(dá)的人類癌細(xì)胞系A(chǔ)375和786-O中的鐵死亡。PK、MK4和Menad三者還能同時挽救由鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3引發(fā)的鐵死亡細(xì)胞，但不能保護(hù)其他類型的細(xì)胞死亡。由于脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的標(biāo)志，通過進(jìn)行基于高分辨率液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）的表血脂組學(xué)分析，用BODYY 581/591 C11和Liperfluo染色細(xì)胞并確定丙二醛濃度來評估脂質(zhì)過氧化水平。這些研究表明，所有三種形式的維生素K都有效地抑制了脂質(zhì)過氧化，并通過獨(dú)立于任何鐵螯合作用的機(jī)制，明顯阻止了RSL3誘導(dǎo)的氧化脂質(zhì)物的形成，其中最突出的是長鏈氧化磷脂酰乙醇胺和磷脂酰乙醇胺縮醛磷脂。這些數(shù)據(jù)表明，維生素K族化合物可作為有效的抗鐵死亡。

維生素K保護(hù)組織免受鐵死亡

隨后，作者使用TAM誘導(dǎo)的肝細(xì)胞特異性Gpx4敲除小鼠測試維生素K（尤其是三者中最有效的MK4）是否也可以在體內(nèi)預(yù)防鐵死亡。小鼠在維生素E缺乏飲食飼養(yǎng)15小時后由于廣泛的肝壞死便很快死亡，值得注意的是，如果用超營養(yǎng)水平的MK4治療則能延長存活時間，并有力逆轉(zhuǎn)相關(guān)的病理變化和肝臟中的脂質(zhì)過氧化。

在小鼠肝臟缺血-再灌注損傷模型中用MK4預(yù)處理改善肝損傷，減少脂質(zhì)過氧化，減少肝細(xì)胞死亡和減少炎癥細(xì)胞浸潤。在腎缺血-再灌注損傷模型中，MK4的預(yù)處理還賦予了對組織損傷的保護(hù)，這反映在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP切口標(biāo)記（TUNEL）陽性腎小管細(xì)胞的數(shù)量減少，腎小管損傷標(biāo)志物腎損傷分子-1（KIM-1）的表達(dá)減少和腎功能的改善。因此，我們得出結(jié)論，在鐵死亡的相關(guān)體內(nèi)模型中，維生素K具有有效的抗鐵死亡作用。

FSP1維持VKH2作為自由基捕獲抗氧化劑的作用

維生素K是一種氧化還原活性的萘醌，在維生素K循環(huán)中轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的對苯二酚（VKH2），VKH2 是強(qiáng)效抗氧化劑。其催化維生素K依賴性蛋白質(zhì)的羧化，包括凝血因子。

由于維生素K和泛醌具有相同的結(jié)構(gòu)特性，作者檢測了FSP1是否可以充當(dāng)維生素K還原酶，產(chǎn)生對苯二酚（VKH2）以抑制脂質(zhì)過氧化。將三種維生素K的任意一種與重組人FSP1（rhFSP1）和NADH共孵育時，NADH被消耗，MK4組會產(chǎn)生MK4-氫醌，證明FSP1催化維生素K的還原。

盡管葉綠醌、MK4和甲萘醌本身不是脂質(zhì)過氧化的抑制劑，但在rhFSP1和NADH存在下，這三種維生素K形式有效地抑制了脂質(zhì)過氧化。NADH本身不抑制脂質(zhì)過氧化，但NADH的供應(yīng)明顯延長了FSP1的三種維生素K形式的抑制期持續(xù)時間，表明NADH起到化學(xué)計(jì)量還原劑的作用，且氧化速率取決于NADH、維生素K和FSP1的濃度，支持FSP1催化的維生素K還原產(chǎn)生的VKH2是活性RTA的觀點(diǎn)。

維生素K通過FSP1阻斷鐵死亡

與上述觀察結(jié)果一致的是，MK4在FSP1-KO細(xì)胞中或者在FSP1抑制劑iFSP14處理后顯示出抗鐵死亡作用減弱，而FSP1的過表達(dá)或撤銷藥理抑制則能恢復(fù)這一功能。然而，在FSP1-KO的細(xì)胞中，如果添加高劑量的葉綠醌和MK4仍然可以防止鐵死亡，說明還存在其他機(jī)制來還原維生素K，盡管效率較低。

FSP1避免華法林中毒

華法林是全球使用最廣泛的抗凝藥物之一，高劑量維生素K是華法林中毒的有效解毒劑。因?yàn)樽銐虻木S生素K輸入可以通過替代維生素K還原途徑為GGCX提供VKH2。由于FSP1能夠還原維生素K，作者進(jìn)一步測試了FSP1是否是在經(jīng)典GGCX-VKOR介導(dǎo)的循環(huán)中，負(fù)責(zé)華法林抗性替代維生素K還原途徑的酶。當(dāng)用MK4處理人肝HepG2細(xì)胞時，它立即通過氫醌代謝為MK4環(huán)氧化物，然后再次轉(zhuǎn)化為MK4。然而，在FSP1缺陷細(xì)胞中尤其是當(dāng)細(xì)胞用華法林處理時，MK4環(huán)氧化物的轉(zhuǎn)化效率顯著降低。隨后，作者在存在或不存在MK4治療的情況下華法林過量的Fsp1+/–和Fsp1–/–小鼠檢查了FSP1在該途徑中的功能，當(dāng)給予高劑量華法林時，用MK4治療的Fsp1–/–小鼠顯示MK4向MK4環(huán)氧化物的轉(zhuǎn)化要少得多，并且仍然顯示出極長的凝血酶原時間。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了FSP1是經(jīng)典維生素K循環(huán)中耐華法林的維生素K還原酶。