抗癌物紫杉醇的發(fā)育路，還看ALDH2的介導(dǎo)幫助

紫杉醇是治療非小細(xì)胞肺癌的主要手段，其耐藥性嚴(yán)重影響病患的生存。然而，其內(nèi)在機(jī)制和潛在的反轉(zhuǎn)策略還需要進(jìn)一步探索。本研究探討了ALDH2在非小細(xì)胞肺癌PTX的耐藥中的功能作用、臨床意義及異常調(diào)控機(jī)制。并通過(guò)一系列研究證明了ALDH2能幫助預(yù)測(cè)病患對(duì)PTX治療的反應(yīng)，ALDH2抑制在臨床上是一種克服PTX耐藥的有前途的策略。本研究于2022年4月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.        ALDH2在NSCLC細(xì)胞中被鑒定為紫杉醇耐藥相關(guān)基因。

作者對(duì)NCI-H460和NCI-H460/PTX細(xì)胞進(jìn)行了基因芯片分析，研究差異表達(dá)的基因。通路分析顯示，與莖干和耐藥相關(guān)的通路顯著富集，表明在肺癌中，莖干的變化包含在PTX的耐藥中（圖1A）。接下來(lái)，作者進(jìn)一步分析了NSCLC細(xì)胞和NSCLC/PTX細(xì)胞的生物學(xué)特征。克隆形成實(shí)驗(yàn)、球體形成實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明NSCLC/PTX細(xì)胞的自我更新和遷移的能力比NSCLC細(xì)胞更強(qiáng)（圖1B）。以上所有結(jié)果表明，NSCLC/PTX細(xì)胞的生物樣特征增強(qiáng)。然后，作者分析了干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明Sox2、Nanog和Oct4在NSCLC/PTX細(xì)胞中的表達(dá)比在NSCLC細(xì)胞中的更高（圖1C）。

作者發(fā)現(xiàn)，在NSCLC/PTX細(xì)胞中ALDH活性明顯高于NSCLC細(xì)胞（圖1D）。在ALDH亞型中，ALDH2在NSCLC/PTX細(xì)胞中的蛋白表達(dá)高于NSCLC（圖1E）。作者利用CCLE和GDSC數(shù)據(jù)庫(kù)分析ALDH2與肺癌PTX之間的關(guān)系。結(jié)果表明，ALDH2的表達(dá)水平與對(duì)PTX的敏感性線性相關(guān)。ALDH2表達(dá)水平越高，細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性越低（圖1F）。作者測(cè)定了46例NSCLC患者PTX治療后組織標(biāo)本中ALDH2的表達(dá)水平，證實(shí)ALDH2與NSCLC患者PTX敏感性的關(guān)系。結(jié)果表明，與低ALDH2組相比，ALDH2蛋白高表達(dá)水平與整體存活率差顯著相關(guān)（圖1G）。綜上所述，ALDH2在NSCLC細(xì)胞的成莖特性積累和PTX耐藥過(guò)程中起重要作用。

圖1非小細(xì)胞肺癌紫杉醇耐藥相關(guān)基因ALDH2的鑒定

2.    當(dāng)ALDH2在NSCLC細(xì)胞中受到藥物抑制劑或基因干預(yù)時(shí)，PTX的療效會(huì)發(fā)生改變。

作者敲低ALDH2后NSCLC/PTX細(xì)胞中PTX的療效顯著升高，而過(guò)表達(dá)ALDH2的NSCLC細(xì)胞中PTX的療效顯著降低（圖2A-B）。作者敲除ALDH2后，NSCLC/PTX細(xì)胞遷移和自我更新能力明顯下降（圖2C）。過(guò)表達(dá)ALDH2后NSCLC細(xì)胞的遷移和自我更新能力明顯增強(qiáng)（圖2D）。ALDH2特異性抑制劑DZN在非細(xì)胞毒性濃度下顯著抑制NSCLC/PTX細(xì)胞中ALDH活性。此外，在非細(xì)胞毒性濃度下，DZN聯(lián)合PTX可顯著增加NSCLC/PTX細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性（圖2E）。作者暫時(shí)沉默ALDH2和其他CSCs相關(guān)的ALDH亞型（ALDH1A1和ALDH3A1），并測(cè)定NSCLC/PTX細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性。結(jié)果表明，其他ALDH亞型的瞬時(shí)沉默對(duì)PTX敏感性無(wú)顯著影響。但當(dāng)ALDH2瞬時(shí)沉默后，NSCLC/PTX細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性明顯增強(qiáng)（圖2F）。綜合以上結(jié)果，說(shuō)明ALDH2是與PTX耐藥相關(guān)的重要ALDH亞型。

研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染，分別建立了單獨(dú)表達(dá)熒光素酶（空載體組）或熒光素酶+ ALDH2（ALDH2過(guò)表達(dá)組）的NCI-H1299和NCI-H460細(xì)胞。然后通過(guò)尾靜脈注射Balb/c-nu小鼠細(xì)胞。結(jié)果表明，注射ALDH2過(guò)表達(dá)細(xì)胞的小鼠肺、腦和骨轉(zhuǎn)移率均高于空載體組（圖2G）。此外，體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示，ALDH2過(guò)表達(dá)的NCI-H1299異種移植瘤對(duì)PTX的耐藥性（抑制率39.36%）高于未過(guò)表達(dá)ALDH2的NCI-H1299異種移植瘤（抑制率53.19 %）（圖2H）。同樣，在NCIH460異種移植瘤模型中也得出了此結(jié)論。綜合以上結(jié)果，說(shuō)明ALDH2與體內(nèi)PTX耐藥有關(guān)。

圖2當(dāng)ALDH2通過(guò)藥物或基因干預(yù)調(diào)控NSCLC細(xì)胞時(shí)，PTX的療效會(huì)發(fā)生改變。

3.      NFYA轉(zhuǎn)錄因子參與ALDH2轉(zhuǎn)錄的激活。

作者們分析了ALDH2的啟動(dòng)子區(qū)域，并根據(jù)PROMO、JASPAR等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NFYA和HNF4A存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。接下來(lái)，作者們采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法測(cè)定NSCLC和NSCLC/PTX中的報(bào)告基因活性。在NSCLC細(xì)胞和NSCLC/PTX細(xì)胞中均見(jiàn)到類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄活性模式。其中包含一個(gè)NFYA結(jié)合位點(diǎn)的P3區(qū)在所檢測(cè)的4種細(xì)胞系中活性最高（圖3B）。這表明NFYA可能是ALDH2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活因子。接下來(lái)，作者們測(cè)定了轉(zhuǎn)錄因子NFYA和HNF4A在NSCLC和NSCLC/PTX細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。NSCLC/PTX細(xì)胞NFYA和HNF4A蛋白水平高于NSCLC細(xì)胞（圖3C）。進(jìn)一步，作者們利用雙熒光素酶報(bào)告法研究了轉(zhuǎn)錄因子NFYA和HNF4A對(duì)ALDH2啟動(dòng)子的調(diào)控能力。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)NFYA或HNF4A質(zhì)粒的NSCLC和NSCLC/PTX細(xì)胞中，ALDH2啟動(dòng)子活性明顯增強(qiáng)（圖3D）。這為這兩種轉(zhuǎn)錄因子在ALDH2轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關(guān)鍵作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

作者對(duì)ALDH2啟動(dòng)子內(nèi)的NFYA和HNF4A結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建了報(bào)告基因pGL3 - ALDH2 – NFYA - M1/M2和pGL3 - ALDH2 - HNF4AM1/M2/M3，并測(cè)定了這些報(bào)告基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。與其他啟動(dòng)子突變質(zhì)粒相比，pGL3 - ALDH2 - NFYA - M1在NSCLC/PTX細(xì)胞中的熒光素酶活性明顯降低，表明ALDH2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活依賴(lài)于NFYA（圖3E）。接下來(lái)構(gòu)建穩(wěn)定敲低NFYA的NSCLC/PTX細(xì)胞，并測(cè)定了ALDH2蛋白水平。結(jié)果表明，ALDH2蛋白在這些細(xì)胞中的表達(dá)水平降低（圖3F）。此外，拯救NFYA表達(dá)時(shí)，ALDH2蛋白表達(dá)水平升高（圖3F）。為明確NFYA與ALDH2之間的關(guān)系，作者采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)49例PTX治療的NSCLC患者組織標(biāo)本中NFYA和ALDH2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，80 % NFYA高表達(dá)患者（n = 20）為高ALDH2表達(dá)組（n = 25），54 % NFYA低表達(dá)患者（n = 13）為低ALDH2表達(dá)組（n = 24）。由此可見(jiàn)，PTX治療NSCLC患者NFYA表達(dá)與ALDH2表達(dá)呈正相關(guān)（圖3G）。綜合以上結(jié)果，證明了NFYA是ALDH2重要的轉(zhuǎn)錄激活因子。

圖3 NFYA轉(zhuǎn)錄因子參與ALDH2轉(zhuǎn)錄的激活

4.      ALDH2的轉(zhuǎn)錄激活受NFYA和EHMT2的協(xié)作調(diào)控。

基因芯片結(jié)果顯示，與NSCLC細(xì)胞相比，NCI-H460/PTX細(xì)胞中一些表觀遺傳學(xué)酶的表達(dá)發(fā)生了改變（圖4A）。因此，作者測(cè)定了一系列表觀遺傳酶抑制劑處理的NSCLC/PTX細(xì)胞中ALDH2蛋白水平。結(jié)果表明，抑制EHMT2（組蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2）的UNC0638在NSCLC/PTX細(xì)胞和NSCLC細(xì)胞中明顯上調(diào)ALDH2（圖4B）。EHMT2增加H3K9me2水平，對(duì)轉(zhuǎn)錄有抑制作用。研究推測(cè)，當(dāng)EHMT2被抑制時(shí)，ALDH2的表達(dá)會(huì)上調(diào)。作者們又測(cè)定了另外三種EHMT2抑制劑（UNC0638、UNC0642、UNC0631）和JMJD抑制劑JIB04處理的NSCLC/PTX細(xì)胞中ALDH2蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EHMT2抑制劑上調(diào)ALDH2蛋白表達(dá)，JIB04具有下調(diào)作用（圖4C）。這些結(jié)果說(shuō)明EHMT2和JMJD通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控ALDH2。

作者們?cè)赨NC0638、UNCC0642和JIB04處理的NSCLC/PTX細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NFYA。結(jié)果表明，當(dāng)NFYA過(guò)表達(dá)或EHMT2被抑制時(shí)，ALDH2啟動(dòng)子活性顯著升高；此外，NFYA過(guò)表達(dá)和EHMT2抑制共同作用于ALDH2的上調(diào)（圖4D-E）。然后，作者在NCI-H460和NCI-H460/PTX細(xì)胞中，繪制了兩個(gè)組蛋白標(biāo)記（H3K9me2, Ac-H3）在全基因組的圖譜。結(jié)果表明，NCI-H460/PTX中H3K9me2峰活性染色質(zhì)信號(hào)較低，Ac-H3峰活性染色質(zhì)信號(hào)較高（圖4F）。此外，研究還驗(yàn)證了與NCI-H460相比，NCIH460/PTX中ALDH2啟動(dòng)子區(qū)H3K9me2的積累減少，而Ac-H3的積累則在ALDH2啟動(dòng)子區(qū)（圖4G頂部和中部）增加。UNC0638處理的NCIH460細(xì)胞，NFYA與ALDH2啟動(dòng)子的結(jié)合能力增強(qiáng)，而JIB04則相反（圖4G底）?？傮w而言，這些結(jié)果提示NFYA是ALDH2的重要轉(zhuǎn)錄激活因子，EHMT2和NFYA在ALDH2的調(diào)控中具有協(xié)同作用。

圖4 ALDH2的轉(zhuǎn)錄激活受NFYA和EHMT2的協(xié)作調(diào)控

5.      ALDH2通過(guò)RAS/RAF通路介導(dǎo)紫杉醇的耐藥性。

對(duì)轉(zhuǎn)染ALDH2或擾亂shRNA的NCI-H460/PTX細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析，結(jié)果顯示，穩(wěn)定敲除ALDH2后，NCI-H460/PTX細(xì)胞中有許多基因差異表達(dá)；其中，511個(gè)shALDH2與Scramble相比有所下降（圖5A）。與NCI-H460相比，NCI-H460/PTX上調(diào)基因間存在富集基因；與Scramble相比，ALDH2 shRNA轉(zhuǎn)染NCI-H460/PTX下調(diào)基因間存在富集基因（圖5B）。通路分析顯示TGF β通路、RAF通路、EMT通路等明顯富集（圖5C），表明這些通路可能參與ALDH2介導(dǎo)的肺癌PTX耐藥。接下來(lái)，作者們研究了RAS/RAF信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與Scramble組相比，ALDH2敲低的NSCLC/PTX細(xì)胞中RAS/RAF信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平持續(xù)下降（圖5D）。因此，我們推測(cè)RAS/RAF信號(hào)通路參與了ALDH2介導(dǎo)的紫杉醇耐藥。然后，作者們過(guò)表達(dá)KRAS和RAF1，并測(cè)定PTX在ALDH2敲除NSCLC/PTX細(xì)胞中的療效。結(jié)果表明，在ALDH2敲低的NSCLC/PTX細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KRAS和RAF1后，PTX的療效下降（圖5E-F）。綜合以上結(jié)果，證明RAS/RAF信號(hào)通路參與了ALDH2介導(dǎo)的PTX抗性。

圖5 敲低ALDH2可抑制NSCLC/PTX細(xì)胞中的RAS/RAF通路

6.      ALDH2的藥理抑制使體內(nèi)外的NSCLC/PTX細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感。

DZN是ALDH2的特異性抑制劑，DSF是ALDH2的非特異性抑制劑。為了驗(yàn)證DZN + PTX或DSF + PTX對(duì)NSCLC/PTX細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有協(xié)同作用，作者采用NCI-H460/PTX異種移植模型，測(cè)定其體內(nèi)靶向ALDH2的抑制效果（圖6A）。結(jié)果顯示，DZN + PTX組和DSF + PTX組腫瘤體積明顯小于PTX單獨(dú)組（圖6B-C）。DZN + PTX組腫瘤重量明顯低于單純PTX（圖6D）。這些結(jié)果表明，靶向抑制ALDH2逆轉(zhuǎn)了PTX抗性。TUNEL染色證實(shí)，與單純PTX相比，DZN + PTX和DSF + PTX顯著增加腫瘤組織細(xì)胞凋亡水平（圖6E）。此外，Western blot結(jié)果證實(shí)PTX聯(lián)合ALDH2抑制劑較單獨(dú)PTX能抑制Erk1/2和MEK1/2磷酸化（圖6F），免疫組化結(jié)果也證實(shí)PTX聯(lián)合ALDH2抑制劑較單獨(dú)PTX能抑制ERK1/2磷酸化（圖6G）。以上數(shù)據(jù)表明，DZN或DSF對(duì)ALDH2的藥理學(xué)抑制作用可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制RAS/RAF信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)NCI-H460/PTX異種移植模型的PTX耐藥性。

圖6 DZN和DSF使體內(nèi)NSCLC/PTX細(xì)胞中紫杉醇的耐藥顯著下降

7.      ALDH2的表觀遺傳下調(diào)使體內(nèi)外NSCLC/PTX細(xì)胞中紫杉醇的耐藥性下降。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了NCI-H460/PTX異種移植瘤模型，研究JIB04和PTX聯(lián)合應(yīng)用能否逆轉(zhuǎn)PTX耐藥（圖7A）。在本模型中，JIB04 + PTX組與PTX單獨(dú)組相比，明顯抑制了相對(duì)腫瘤體積和腫瘤重量（圖7B和C）。以上結(jié)果表明，JIB04與PTX合用，提高了PTX的抗腫瘤作用，逆轉(zhuǎn)了PTX的耐藥性。在NCI-H460/PTX腫瘤組織中，Western blot和免疫化學(xué)進(jìn)一步證實(shí)JIB04下調(diào)ALDH2（圖7D和E）。TUNEL染色也證實(shí)JIB04 + PTX顯著增加腫瘤細(xì)胞的凋亡水平（圖7F）?？偟膩?lái)說(shuō)，表明JIB04與PTX聯(lián)合誘導(dǎo)PTX耐藥的NSCLC移植瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)用EHMT2抑制劑UNC0642替代DZN上調(diào)ALDH2表達(dá)時(shí)，腫瘤體積較其他兩組增大（圖7G）。綜上所述，ALDH2的表達(dá)可通過(guò)表觀遺傳學(xué)途徑調(diào)控，從而影響NSCLC對(duì)PTX的敏感性。

圖7 JIB04使體內(nèi)NSCLC/PTX細(xì)胞中紫杉醇的耐藥顯著下降

圖8 研究結(jié)果圖

結(jié)論

本研究結(jié)果總結(jié)在一個(gè)示意圖（圖8）。抑制EHMT2和同時(shí)過(guò)表達(dá)NFYA可上調(diào)ALDH2的表達(dá)，該信號(hào)軸參與介導(dǎo)體內(nèi)外對(duì)PTX的耐藥。從機(jī)制上講，NFYA是ALDH2重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，EHMT2通過(guò)增加H3K9me2水平使染色質(zhì)致密化。抑制EHMT2可促進(jìn)NFYA與ALDH2啟動(dòng)子結(jié)合，從而激活A(yù)LDH2的轉(zhuǎn)錄。DZN、DSF或JIB04抑制或下調(diào)ALDH2可增加PTX對(duì)NSCLC/PTX細(xì)胞或移植瘤的療效，逆轉(zhuǎn)PTX耐藥。本研究結(jié)果揭示了一種抑制或下調(diào)促瘤基因的新策略，可能為克服PTX耐藥提供了突破口。

參考文獻(xiàn)

Wang W, Wang J, Liu S, Ren Y, Wang J, Liu S, Cui W, Jia L, Tang X, Yang J, Wu C, Wang L. (2022). An EHMT2/NFYA-ALDH2 signaling axis modulates the RAF pathway to regulate paclitaxel resistance in lung cancer. Mol Cancer. 2022 Apr 27;21(1):106. doi: 10.1186/s12943-022-01579-9.