RNA結(jié)合蛋白HuR通過抑制長鏈非編碼RNA H19的表達來保護NAFLD
NAFLD已成為全球最常見的慢性肝病。人抗原R （Human antigen R, HuR）是一種RNA結(jié)合蛋白，也是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)HuR在調(diào)節(jié)肝臟和脂肪組織的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。然而，在代謝應(yīng)激下，肝細(xì)胞特異性HuR調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的潛在機制仍不清楚。近日，有研究發(fā)現(xiàn)HuR不僅作為RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達，還調(diào)節(jié)H19啟動子活性。肝臟HuR通過調(diào)節(jié)H19的表達，是肝臟脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子。該研究發(fā)表在《Cell & Bioscience》，IF：9.584。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. 肝細(xì)胞特異性HuR缺陷增強了WDSW誘導(dǎo)的NAFLD
為了明確HuR在NAFLD疾病進展中的肝細(xì)胞特異性作用，通過尾靜脈注射AAV8-TBGP-Cre重組酶的HuRflox/flox小鼠建立HuRhKO小鼠，并以AAV8-TBGP-GFP作為對照。如圖1a, b所示，肝細(xì)胞特異性敲除HuR加重了WDSW-誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)蓄積和4周喂養(yǎng)后的肝損傷：表現(xiàn)為脂質(zhì)蓄積增加，AST和ALT水平升高，且HuRhKO小鼠的肝臟甘油三酯和膽固醇水平遠(yuǎn)高于對照小鼠（圖1c）。此外，如圖1所示，在WDSW喂養(yǎng)4周后，TCA在總膽汁酸中的百分比從10%（對照）顯著增加到23% （HuRhKO），而βMCA從26%（對照）顯著降低到15% （HuRhKO）。HuRhKO小鼠血清總膽汁酸水平顯著升高，包括總初級、次級和結(jié)合膽汁酸（圖1e）。
圖1肝細(xì)胞特異性HuR缺乏增強WDSW誘導(dǎo)的NAFLD
2. 肝細(xì)胞特異性HuR缺陷通過調(diào)節(jié)整體轉(zhuǎn)錄組譜增強了WDSW誘導(dǎo)的NAFLD
為了闡明肝臟HuR缺乏導(dǎo)致NAFLD疾病進展的潛在機制，進行了RNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析。如圖2a, b所示，與對照組小鼠相比，WDSW飼喂導(dǎo)致HuRhKO小鼠中192個基因表達上調(diào)，160個基因表達下調(diào)。
圖2肝細(xì)胞特異性HuR缺失通過調(diào)節(jié)整體轉(zhuǎn)錄組譜增強WDSW誘導(dǎo)的NAFLD
3. 肝細(xì)胞特異性HuR缺乏增強WDSW誘導(dǎo)的脂肪酸和脂質(zhì)代謝失調(diào)
如圖2c所示，在WDSW喂養(yǎng)4周后，與對照組小鼠相比，HuRhKO小鼠中脂肪酸生物合成途徑中涉及的大部分基因增加：包括Acc1、Fasn、Elov16、Fads1/ 2、LXRα/β、Ppar α/β、Cpt1α、Pnpla3和Atgl等。q-PCR結(jié)果顯示（圖2d），與對照組小鼠相比，在WDSW喂養(yǎng)4周后，Acc1、Fasn、Elov16、Fads1/ 2、LXRα/β、Ppar α/β、Cpt1α、Pnpla3和Atgl的mRNA水平在HuRhKO小鼠中顯著增加。
4. 肝細(xì)胞特異性HuR缺陷增強了WDSW誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激
RNA-seq分析顯示，在WDSW喂養(yǎng)4周的HuRhKO小鼠中，F(xiàn)4/80免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，肝細(xì)胞特異性敲除HuR促進WDSW誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向肝臟浸潤，在各種巨噬細(xì)胞上高水平表達的成熟細(xì)胞表面糖蛋白（圖3a）。q-PCR結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞的主要標(biāo)志基因、炎性細(xì)胞因子和趨化因子F4/80、Cd68、Cd63、Integrin alpha M （圖3b）、Cxcl1、Cxcl10、Ccl2、Ccr2、IL-1α、IL-1β、Tnfα和IL-6等的mRNA表達水平顯著升高（圖3c）。中性粒細(xì)胞的不適當(dāng)激活會導(dǎo)致組織損傷，這已經(jīng)涉及到不同的疾病，包括各種肝臟疾病。在本研究中，參與中性粒細(xì)胞活化的主要基因如Nox2， Ncf2， Ncf4， Cybα， IL-2rγ，ICAM1和Vcam1，在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠的肝臟中顯著上調(diào)（圖3d）。
圖3肝細(xì)胞特異性HuR缺乏增強WDSW誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激
5. HuR是lncRNA H19轉(zhuǎn)錄的抑制因子
先前的研究表明lncRNA H19的異常表達與包括NASH在內(nèi)的多種肝臟疾病的肝臟炎癥和肝纖維化密切相關(guān)。為了進一步確定肝臟中HuR的缺失促進NAFLD進展的潛在機制，檢測了H19在人類NASH患者和WDSW誘導(dǎo)的NASH小鼠模型肝臟中的表達。如圖4a所示，與健康對照相比，人類NASH患者的肝臟H19 mRNA水平增加了10倍以上。類似地，在喂食WDSW 21周的NASH小鼠中，與對照小鼠相比，肝臟H19 mRNA水平增加了30倍以上（圖4b）。對來自最近一項研究（GSE143358）的公開RNAseq數(shù)據(jù)集的分析表明，H19是肝臟特異性HuR敲除小鼠中上調(diào)最顯著的基因（圖4c）。另外，在喂食WDSW 4周的HuRhKO小鼠肝臟中，H19顯著上調(diào)（圖4d）。熒光素酶報告基因?qū)嶒炈荆^表達HuR顯著抑制H19啟動子活性（圖4e）。為了進一步確定H19在體內(nèi)肝臟脂肪變性和炎癥中的作用，H19 - / -小鼠和WT小鼠被喂養(yǎng)4周的WDSW。結(jié)果顯示，WDSW誘導(dǎo)的H19 - / -小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積得到保護（圖4f）。
圖4 HuR是lncRNA H19轉(zhuǎn)錄的抑制因子
6. HuR調(diào)節(jié)SphK2和S1PR2的表達
有研究報道鞘脂分解代謝的關(guān)鍵酶SphK2在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。與接受兩周高脂飲食的對照組小鼠相比，SphK2基因缺陷（SphK2 - / -）小鼠出現(xiàn)了明顯的脂肪肝。SphK2主要定位于細(xì)胞核。如圖5a所示，與對照組小鼠相比，WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠肝臟中SphK2的核蛋白水平顯著降低。H19缺失增加SphK2核蛋白水平（圖5b）。如圖5c, d所示，人NASH患者和WDSW誘導(dǎo)的NASH小鼠模型肝臟中S1PR2 mRNA水平顯著上調(diào)。同樣，在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠中，S1PR2的mRNA和蛋白水平均顯著升高。熒光素酶報告實驗顯示S1PR2顯著增強H19啟動子活性（圖5e）。
圖5 HuR調(diào)節(jié)SphK2和S1PR2的表達
7. 肝細(xì)胞特異性HuR缺陷增強了WDSW誘導(dǎo)的膽汁酸穩(wěn)態(tài)失調(diào)
膽汁酸是重要的信號分子，在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)、葡萄糖和能量代謝中起關(guān)鍵作用。血清膽汁酸水平的LC-MS /MS分析表明，肝細(xì)胞特異性HuR缺陷加重了WDSW誘導(dǎo)的膽汁酸穩(wěn)態(tài)破壞（圖1d, e）。q-PCR分析顯示，膽汁酸合成途徑中的兩種限速酶Cyp7α1和Cyp27α1的表達水平顯著降低。相反，Shp和Ntcp的表達水平在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO的肝臟中顯著上調(diào)（圖6a）。為了進一步確定肝細(xì)胞特異性缺失HuR對腸肝循環(huán)的影響，使用LC-MS /MS檢測了肝臟、回腸和盲腸內(nèi)容物中的膽汁酸組成和水平。如圖6b所示，TCA在肝臟總膽汁酸中的百分比從27%（對照）增加到40% （HuRhKO），而βMCA從39%（對照）降低到24% （HuRhKO）。雖然在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠和對照小鼠之間，肝臟總膽汁酸無顯著變化，但在HuRhKO小鼠中，TCA水平、總初級結(jié)合膽汁酸與總初級未結(jié)合膽汁酸的比值、總結(jié)合膽汁酸與總未結(jié)合膽汁酸的比值和總二級結(jié)合膽汁酸與總二級未結(jié)合膽汁酸的比值均升高（圖6c）。然而，肝細(xì)胞HuR缺乏顯著降低了盲腸內(nèi)容物中的膽汁酸水平 （圖6d）。
圖6肝細(xì)胞特異性HuR缺乏增強WDSW誘導(dǎo)的膽汁酸穩(wěn)態(tài)失調(diào)
8. 肝細(xì)胞特異性HuR缺陷增強了WDSW誘導(dǎo)的肝纖維化
為了進一步研究肝臟HuR在WDSW誘導(dǎo)的NAFLD疾病進展中的影響，對照組和HuRhKO小鼠自由進食12周的WDSW誘導(dǎo)NASH和早期纖維化。蘇木精-伊紅染色顯示，喂食WDSW 12周的HuRhKO小鼠出現(xiàn)了加重的腺泡內(nèi)（小葉）炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變和大泡性脂肪變性（圖7a）。與在HuRhKO小鼠中進行的4周WDSW喂養(yǎng)研究（圖4d）相似，在12周WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠中，肝臟H19表達水平顯著上調(diào)（圖7b）。如圖7c所示，喂養(yǎng)WDSW 12周的HuRhKO小鼠肝臟巨噬細(xì)胞浸潤增強，可見F4/80的免疫組化染色。如圖7c所示，12周WDSW喂養(yǎng)在HuRhKO小鼠中誘導(dǎo)了早期纖維化，但在對照組小鼠中誘導(dǎo)的纖維化要少得多。CK-19染色顯示肝細(xì)胞特異性HuR缺陷顯著加重了WDSW誘導(dǎo)的膽管細(xì)胞增殖。在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠中，Ck19、α-Sma、Tgfβ1、Loxl2、sox4/9、Ctgf、Mmp2/7、Sctr、Postn和S1pr2的mRNA表達水平顯著上調(diào)，表明肝細(xì)胞特異性HuR缺陷加重WDSW誘導(dǎo)的肝纖維化（圖7d）。
圖7肝細(xì)胞特異性HuR缺乏加重WDSW誘導(dǎo)的肝纖維化
9. H19下調(diào)可緩解WDSW誘導(dǎo)的HuRhKO小鼠NAFLD
H19上調(diào)可能是WDSW誘導(dǎo)的HuRhKO小鼠NAFLD的主要細(xì)胞機制。為了驗證H19在WDSW誘導(dǎo)的HuRhKO小鼠NAFLD中的作用HuRhKO小鼠被注射編碼H19-shRNA的重組腺病毒或?qū)φ障俨《荆℅FP），同時自由進食WDSW 4周。如圖8a所示，與注射對照腺病毒相比，注射H19-shRNA腺病毒后，肝臟中H19水平顯著降低。H19的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了WDSW誘導(dǎo)的SphK2核內(nèi)蛋白的降低（圖8b）。H&E染色顯示，在HuRhKO小鼠中，H19的下調(diào)減輕了WDSW誘導(dǎo)的腺泡內(nèi)（小葉）炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變和大泡性脂肪變性（圖8c）。Picro-Sirius Red染色還表明，在HuRhKO小鼠中，H19的下調(diào)減少了WDSW誘導(dǎo)的早期纖維化（圖8d）?？傊?，這些結(jié)果表明，上調(diào)H19至少部分地促進了WDSW誘導(dǎo)的HuRhKO小鼠NAFLD的發(fā)展。
圖8 H19下調(diào)緩解WDSW誘導(dǎo)的HuRhKO小鼠NAFLD
結(jié)論：
綜上所述，本研究表明HuR通過抑制H19表達和調(diào)節(jié)SphK2核蛋白水平，在肝臟脂質(zhì)代謝、腸肝膽汁酸穩(wěn)態(tài)、炎癥和纖維化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用（圖8e）。膽汁酸誘導(dǎo)的S1PR2激活也可能通過上調(diào)H19參與NASH纖維化。此外，HuR的磷酸化狀態(tài)影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位。肝細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)HuR的表達及其下游靶點H19可能被用于開發(fā)NAFLD的潛在治療靶點。