RNA結合蛋白HuR通過抑制長鏈非編碼RNA H19的表達來保護NAFLD
NAFLD已成為全球最常見的慢性肝病。人抗原R （Human antigen R, HuR）是一種RNA結合蛋白，也是一種重要的轉錄后調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)HuR在調(diào)節(jié)肝臟和脂肪組織的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用。然而，在代謝應激下，肝細胞特異性HuR調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的潛在機制仍不清楚。近日，有研究發(fā)現(xiàn)HuR不僅作為RNA結合蛋白調(diào)節(jié)轉錄后基因表達，還調(diào)節(jié)H19啟動子活性。肝臟HuR通過調(diào)節(jié)H19的表達，是肝臟脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子。該研究發(fā)表在《Cell & Bioscience》，IF：9.584。
技術路線：
主要研究結果：
1. 肝細胞特異性HuR缺陷增強了WDSW誘導的NAFLD
為了明確HuR在NAFLD疾病進展中的肝細胞特異性作用，通過尾靜脈注射AAV8-TBGP-Cre重組酶的HuRflox/flox小鼠建立HuRhKO小鼠，并以AAV8-TBGP-GFP作為對照。如圖1a, b所示，肝細胞特異性敲除HuR加重了WDSW-誘導的肝臟脂質(zhì)蓄積和4周喂養(yǎng)后的肝損傷：表現(xiàn)為脂質(zhì)蓄積增加，AST和ALT水平升高，且HuRhKO小鼠的肝臟甘油三酯和膽固醇水平遠高于對照小鼠（圖1c）。此外，如圖1所示，在WDSW喂養(yǎng)4周后，TCA在總膽汁酸中的百分比從10%（對照）顯著增加到23% （HuRhKO），而βMCA從26%（對照）顯著降低到15% （HuRhKO）。HuRhKO小鼠血清總膽汁酸水平顯著升高，包括總初級、次級和結合膽汁酸（圖1e）。
圖1肝細胞特異性HuR缺乏增強WDSW誘導的NAFLD
2. 肝細胞特異性HuR缺陷通過調(diào)節(jié)整體轉錄組譜增強了WDSW誘導的NAFLD
為了闡明肝臟HuR缺乏導致NAFLD疾病進展的潛在機制，進行了RNA-seq轉錄組分析。如圖2a, b所示，與對照組小鼠相比，WDSW飼喂導致HuRhKO小鼠中192個基因表達上調(diào)，160個基因表達下調(diào)。
圖2肝細胞特異性HuR缺失通過調(diào)節(jié)整體轉錄組譜增強WDSW誘導的NAFLD
3. 肝細胞特異性HuR缺乏增強WDSW誘導的脂肪酸和脂質(zhì)代謝失調(diào)
如圖2c所示，在WDSW喂養(yǎng)4周后，與對照組小鼠相比，HuRhKO小鼠中脂肪酸生物合成途徑中涉及的大部分基因增加：包括Acc1、Fasn、Elov16、Fads1/ 2、LXRα/β、Ppar α/β、Cpt1α、Pnpla3和Atgl等。q-PCR結果顯示（圖2d），與對照組小鼠相比，在WDSW喂養(yǎng)4周后，Acc1、Fasn、Elov16、Fads1/ 2、LXRα/β、Ppar α/β、Cpt1α、Pnpla3和Atgl的mRNA水平在HuRhKO小鼠中顯著增加。
4. 肝細胞特異性HuR缺陷增強了WDSW誘導的炎癥和氧化應激
RNA-seq分析顯示，在WDSW喂養(yǎng)4周的HuRhKO小鼠中，F(xiàn)4/80免疫組織化學染色結果顯示，肝細胞特異性敲除HuR促進WDSW誘導的巨噬細胞向肝臟浸潤，在各種巨噬細胞上高水平表達的成熟細胞表面糖蛋白（圖3a）。q-PCR結果顯示，巨噬細胞的主要標志基因、炎性細胞因子和趨化因子F4/80、Cd68、Cd63、Integrin alpha M （圖3b）、Cxcl1、Cxcl10、Ccl2、Ccr2、IL-1α、IL-1β、Tnfα和IL-6等的mRNA表達水平顯著升高（圖3c）。中性粒細胞的不適當激活會導致組織損傷，這已經(jīng)涉及到不同的疾病，包括各種肝臟疾病。在本研究中，參與中性粒細胞活化的主要基因如Nox2， Ncf2， Ncf4， Cybα， IL-2rγ，ICAM1和Vcam1，在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠的肝臟中顯著上調(diào)（圖3d）。
圖3肝細胞特異性HuR缺乏增強WDSW誘導的炎癥和氧化應激
5. HuR是lncRNA H19轉錄的抑制因子
先前的研究表明lncRNA H19的異常表達與包括NASH在內(nèi)的多種肝臟疾病的肝臟炎癥和肝纖維化密切相關。為了進一步確定肝臟中HuR的缺失促進NAFLD進展的潛在機制，檢測了H19在人類NASH患者和WDSW誘導的NASH小鼠模型肝臟中的表達。如圖4a所示，與健康對照相比，人類NASH患者的肝臟H19 mRNA水平增加了10倍以上。類似地，在喂食WDSW 21周的NASH小鼠中，與對照小鼠相比，肝臟H19 mRNA水平增加了30倍以上（圖4b）。對來自最近一項研究（GSE143358）的公開RNAseq數(shù)據(jù)集的分析表明，H19是肝臟特異性HuR敲除小鼠中上調(diào)最顯著的基因（圖4c）。另外，在喂食WDSW 4周的HuRhKO小鼠肝臟中，H19顯著上調(diào)（圖4d）。熒光素酶報告基因實驗所示，過表達HuR顯著抑制H19啟動子活性（圖4e）。為了進一步確定H19在體內(nèi)肝臟脂肪變性和炎癥中的作用，H19 - / -小鼠和WT小鼠被喂養(yǎng)4周的WDSW。結果顯示，WDSW誘導的H19 - / -小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積得到保護（圖4f）。
圖4 HuR是lncRNA H19轉錄的抑制因子
6. HuR調(diào)節(jié)SphK2和S1PR2的表達
有研究報道鞘脂分解代謝的關鍵酶SphK2在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。與接受兩周高脂飲食的對照組小鼠相比，SphK2基因缺陷（SphK2 - / -）小鼠出現(xiàn)了明顯的脂肪肝。SphK2主要定位于細胞核。如圖5a所示，與對照組小鼠相比，WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠肝臟中SphK2的核蛋白水平顯著降低。H19缺失增加SphK2核蛋白水平（圖5b）。如圖5c, d所示，人NASH患者和WDSW誘導的NASH小鼠模型肝臟中S1PR2 mRNA水平顯著上調(diào)。同樣，在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠中，S1PR2的mRNA和蛋白水平均顯著升高。熒光素酶報告實驗顯示S1PR2顯著增強H19啟動子活性（圖5e）。
圖5 HuR調(diào)節(jié)SphK2和S1PR2的表達
7. 肝細胞特異性HuR缺陷增強了WDSW誘導的膽汁酸穩(wěn)態(tài)失調(diào)
膽汁酸是重要的信號分子，在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)、葡萄糖和能量代謝中起關鍵作用。血清膽汁酸水平的LC-MS /MS分析表明，肝細胞特異性HuR缺陷加重了WDSW誘導的膽汁酸穩(wěn)態(tài)破壞（圖1d, e）。q-PCR分析顯示，膽汁酸合成途徑中的兩種限速酶Cyp7α1和Cyp27α1的表達水平顯著降低。相反，Shp和Ntcp的表達水平在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO的肝臟中顯著上調(diào)（圖6a）。為了進一步確定肝細胞特異性缺失HuR對腸肝循環(huán)的影響，使用LC-MS /MS檢測了肝臟、回腸和盲腸內(nèi)容物中的膽汁酸組成和水平。如圖6b所示，TCA在肝臟總膽汁酸中的百分比從27%（對照）增加到40% （HuRhKO），而βMCA從39%（對照）降低到24% （HuRhKO）。雖然在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠和對照小鼠之間，肝臟總膽汁酸無顯著變化，但在HuRhKO小鼠中，TCA水平、總初級結合膽汁酸與總初級未結合膽汁酸的比值、總結合膽汁酸與總未結合膽汁酸的比值和總二級結合膽汁酸與總二級未結合膽汁酸的比值均升高（圖6c）。然而，肝細胞HuR缺乏顯著降低了盲腸內(nèi)容物中的膽汁酸水平 （圖6d）。
圖6肝細胞特異性HuR缺乏增強WDSW誘導的膽汁酸穩(wěn)態(tài)失調(diào)
8. 肝細胞特異性HuR缺陷增強了WDSW誘導的肝纖維化
為了進一步研究肝臟HuR在WDSW誘導的NAFLD疾病進展中的影響，對照組和HuRhKO小鼠自由進食12周的WDSW誘導NASH和早期纖維化。蘇木精-伊紅染色顯示，喂食WDSW 12周的HuRhKO小鼠出現(xiàn)了加重的腺泡內(nèi)（小葉）炎癥、肝細胞氣球樣變和大泡性脂肪變性（圖7a）。與在HuRhKO小鼠中進行的4周WDSW喂養(yǎng)研究（圖4d）相似，在12周WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠中，肝臟H19表達水平顯著上調(diào)（圖7b）。如圖7c所示，喂養(yǎng)WDSW 12周的HuRhKO小鼠肝臟巨噬細胞浸潤增強，可見F4/80的免疫組化染色。如圖7c所示，12周WDSW喂養(yǎng)在HuRhKO小鼠中誘導了早期纖維化，但在對照組小鼠中誘導的纖維化要少得多。CK-19染色顯示肝細胞特異性HuR缺陷顯著加重了WDSW誘導的膽管細胞增殖。在WDSW喂養(yǎng)的HuRhKO小鼠中，Ck19、α-Sma、Tgfβ1、Loxl2、sox4/9、Ctgf、Mmp2/7、Sctr、Postn和S1pr2的mRNA表達水平顯著上調(diào)，表明肝細胞特異性HuR缺陷加重WDSW誘導的肝纖維化（圖7d）。
圖7肝細胞特異性HuR缺乏加重WDSW誘導的肝纖維化
9. H19下調(diào)可緩解WDSW誘導的HuRhKO小鼠NAFLD
H19上調(diào)可能是WDSW誘導的HuRhKO小鼠NAFLD的主要細胞機制。為了驗證H19在WDSW誘導的HuRhKO小鼠NAFLD中的作用HuRhKO小鼠被注射編碼H19-shRNA的重組腺病毒或對照腺病毒（GFP），同時自由進食WDSW 4周。如圖8a所示，與注射對照腺病毒相比，注射H19-shRNA腺病毒后，肝臟中H19水平顯著降低。H19的下調(diào)逆轉了WDSW誘導的SphK2核內(nèi)蛋白的降低（圖8b）。H&E染色顯示，在HuRhKO小鼠中，H19的下調(diào)減輕了WDSW誘導的腺泡內(nèi)（小葉）炎癥、肝細胞氣球樣變和大泡性脂肪變性（圖8c）。Picro-Sirius Red染色還表明，在HuRhKO小鼠中，H19的下調(diào)減少了WDSW誘導的早期纖維化（圖8d）。總之，這些結果表明，上調(diào)H19至少部分地促進了WDSW誘導的HuRhKO小鼠NAFLD的發(fā)展。
圖8 H19下調(diào)緩解WDSW誘導的HuRhKO小鼠NAFLD
結論：
綜上所述，本研究表明HuR通過抑制H19表達和調(diào)節(jié)SphK2核蛋白水平，在肝臟脂質(zhì)代謝、腸肝膽汁酸穩(wěn)態(tài)、炎癥和纖維化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用（圖8e）。膽汁酸誘導的S1PR2激活也可能通過上調(diào)H19參與NASH纖維化。此外，HuR的磷酸化狀態(tài)影響其在細胞內(nèi)的定位。肝細胞特異性調(diào)節(jié)HuR的表達及其下游靶點H19可能被用于開發(fā)NAFLD的潛在治療靶點。