三陰性乳腺癌化療和免疫治療期間固有和適應(yīng)性腫瘤內(nèi)免疫的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖

乳腺癌（BC）是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，是全球主要的健康問(wèn)題。目前，BC的治療方案主要取決于組織學(xué)類(lèi)型、分子標(biāo)志物、臨床侵襲性和疾病分期。免疫療法與化療在三陰性乳腺癌（TNBC）中顯示出聯(lián)合臨床活性，這表明一些治療組合比其他治療組合更有效。然而，目前尚未對(duì)參與這些治療的主要免疫細(xì)胞群進(jìn)行明確概述。近日，有研究使用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)兩種三陰性乳腺癌小鼠模型的腫瘤微環(huán)境（TME）中的免疫景觀(guān)進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)表在《Cell Death Discovery》，IF：7.109。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1. 兩種TNBC小鼠細(xì)胞系腫瘤微環(huán)境中的全免疫細(xì)胞景觀(guān)

經(jīng)過(guò)質(zhì)控，4T1的細(xì)胞總數(shù)和基因總數(shù)分別為22,403和18,124，而EMT6的細(xì)胞總數(shù)和基因總數(shù)分別為26,245和18,637。4T1和EMT6細(xì)胞TME中共識(shí)別出20組和22組具有相似基因表達(dá)的細(xì)胞（圖1）。

20個(gè)4T1細(xì)胞簇被分類(lèi)為5個(gè)B細(xì)胞簇、5個(gè)Cd4 T細(xì)胞簇、3個(gè)Cd8 T細(xì)胞簇、1個(gè)NK細(xì)胞簇、1個(gè)T γδ細(xì)胞簇、2個(gè)DC細(xì)胞簇、2個(gè)巨噬細(xì)胞簇和1個(gè)中性粒細(xì)胞簇（圖1A）。另一方面，EMT6細(xì)胞系呈現(xiàn)22個(gè)細(xì)胞簇，分別為8個(gè)巨噬細(xì)胞簇、1個(gè)單核細(xì)胞簇、1個(gè)中性粒細(xì)胞簇、3個(gè)B細(xì)胞簇、3個(gè)DC細(xì)胞簇、4個(gè)Cd4 T細(xì)胞簇、1個(gè)Cd8 T細(xì)胞簇和1個(gè)NK細(xì)胞簇（圖1B）。

圖1 TNBC小鼠TME的免疫細(xì)胞景觀(guān)

2. 4T1細(xì)胞 TME中的Cd4 T細(xì)胞樣亞簇揭示了小鼠特異性T細(xì)胞群的促腫瘤活性

根據(jù)標(biāo)簽賦值，將主要包含Cd4、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和γδ T細(xì)胞的細(xì)胞簇重新聚類(lèi)。這一過(guò)程產(chǎn)生了7個(gè)簇（圖2A）：兩個(gè)祖細(xì)胞樣Cd4 T細(xì)胞簇（0和2），以Sell、Ccr7、Lef1和Tcf7基因的高表達(dá)為特征（圖2B）；Cd8樣細(xì)胞簇（簇3）顯示Cd8a基因的高表達(dá)，這些細(xì)胞可能是來(lái)源于具有混合細(xì)胞組成的細(xì)胞簇的細(xì)胞亞群，因?yàn)榘珻d4細(xì)胞群而被回收；Treg樣細(xì)胞簇（簇1）表達(dá)高水平的Foxp3和Ikzf2基因；表達(dá)Trdc基因的γδ T細(xì)胞簇（簇4）；最后，兩個(gè)具有高表達(dá)Nr4a1和Tox基因標(biāo)記的耗竭樣Cd4 T細(xì)胞簇（5和6）。偽時(shí)間軌跡證實(shí)并擴(kuò)展了對(duì)這一子簇組成的理解（圖2C）。三個(gè)不同的軌跡或集群分化總是從同一個(gè)根（簇2）開(kāi)始。第一種將根（簇2）連接到經(jīng)過(guò)第二祖細(xì)胞樣簇（簇0）的γδ T細(xì)胞簇。第二種軌跡中軌跡的末端是CD8樣簇（簇3）。而在第三種軌跡中，簇2生成經(jīng)過(guò)另一種耗盡狀態(tài)的耗盡樣簇5（簇6）（圖2C）。在不同條件下，每個(gè)簇的細(xì)胞百分比差異顯著（圖2D）。γδ T細(xì)胞簇（簇4）在對(duì)照組中較高，在所有處理中均低于對(duì)照組（圖2E）。

圖2 4T1中Cd4-like T細(xì)胞亞簇分析

3. 4T1三陰性乳腺癌TME中CD8 T細(xì)胞樣成分

CD8 T細(xì)胞的亞群確定了7個(gè)簇（圖3A），這些簇也在本例中與基于一系列基因標(biāo)記的不同細(xì)胞類(lèi)型相關(guān)（圖3B）。Sell、Lef1、Tcf7和Ccr7基因的表達(dá)證實(shí)了兩個(gè)祖細(xì)胞樣Cd8簇（0和1）。3個(gè)簇（簇3、4和6）具有終末分化特征。簇3高表達(dá)細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ccnb2、Cdk1、Mki67和Top2a。簇4是最活躍的簇，因?yàn)樗哂懈咚降腉zmb, Gzmk, Ifng和Ly6c1基因標(biāo)記。簇6高表達(dá)Pdcd1、Lag3、Ctla4、Havcr2，定義為耗竭樣CD8簇。最后，簇5與Ncr1基因高水平表達(dá)的NKs相關(guān)（圖3B）。對(duì)于耗竭樣CD8 T細(xì)胞簇（簇6）在涉及環(huán)磷酰胺的治療中減少或未被發(fā)現(xiàn)，而在未治療的TME中它們的百分比較高。同樣，在未處理的對(duì)照中發(fā)現(xiàn)簇4富集，而在C140、C140 + V和C140 + αPD-1處理中，簇4的細(xì)胞百分比下降（圖3D-F）。此外，軌跡分析顯示Cd8 T細(xì)胞樣亞群的表型異質(zhì)性與Cd4細(xì)胞的表型異質(zhì)性相同。對(duì)于Cd4亞簇，Cd8亞簇的軌跡（圖3C）顯示了三個(gè)不同的譜系，它們共享一個(gè)作為根的簇。該細(xì)胞簇為祖細(xì)胞樣細(xì)胞簇1。第一個(gè)軌跡將根與最耗竭的Cd8簇（簇6）相連。第二個(gè)相關(guān)的簇1與NKs的簇相連；而第三條軌跡顯示了與最活躍的Cd8簇（簇4）通過(guò)簇2的聯(lián)系。這一分析證實(shí)了之前的分配和每個(gè)基因簇的基因表達(dá)特征。

圖3 4T1中Cd8-like T細(xì)胞亞簇分析

4. EMT6細(xì)胞TME中的M1和M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞群

在EMT6 細(xì)胞TME中發(fā)現(xiàn)的大量巨噬細(xì)胞允許這些細(xì)胞亞集群。這導(dǎo)致了9個(gè)共享相似轉(zhuǎn)錄譜的細(xì)胞簇的鑒定（圖4A）；其中簇2、5和6由于Cx3cr1基因的表達(dá)和Ly6c1基因的陰性表達(dá)而與M2型巨噬細(xì)胞亞型相關(guān)（圖4B）。觀(guān)察每個(gè)簇在不同條件下的細(xì)胞比例，最相關(guān)的結(jié)果是M2樣簇2、5和6（圖4C-E），它們表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)：它們的細(xì)胞數(shù)量在未經(jīng)治療的情況下有很高的頻率，在所有涉及環(huán)磷酰胺的治療中都有所下降。另一方面，M1樣簇1僅在環(huán)磷酰胺聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱（C140 + V）處理時(shí)表現(xiàn)出顯著增加（圖4F）。

圖4 EMT6中巨噬樣細(xì)胞亞簇分析

5. 兩種細(xì)胞系TME中共同的B細(xì)胞亞簇比例

由于在兩個(gè)TNBC細(xì)胞系TME中被歸類(lèi)為B細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，作者探究了這些細(xì)胞群的亞集群的異同（圖5）。4T1細(xì)胞系的TME顯示出5個(gè)集群，而EMT6的TME中觀(guān)察到8個(gè)集群。EMT6模型具有更結(jié)構(gòu)化的子集群，揭示了更多的亞種群。其中，EMT6簇4類(lèi)似于干擾素誘導(dǎo)的幼稚B細(xì)胞（表達(dá)Ifit3），而簇1和簇2作為4T1中屬于簇1的細(xì)胞的一部分，通過(guò)Pim1的表達(dá)可以清楚地歸類(lèi)為介于增殖和幼稚樣B細(xì)胞之間的中間狀態(tài)（圖5C, D）。同樣，簇4和簇7分別在4T1和EMT6中表達(dá)Cd38基因，但Mki67基因不表達(dá)（圖5C, D）。此外，在兩個(gè)細(xì)胞系中，經(jīng)處理和未處理的tme之間，共享相同轉(zhuǎn)錄譜的細(xì)胞比例大致相當(dāng)。事實(shí)上，在未處理的樣本中，germinal B細(xì)胞（4T1和EMT6中簇4和7）數(shù)量很少，而在C140 + αPD-1處理中，兩種小鼠模型的germinal B細(xì)胞均增加（圖5F-H）。此外，proliferative B細(xì)胞群的比例也有相似之處 （圖5E, G）。對(duì)于4T1的簇2和EMT6中簇3，順鉑+ αPD-1條件下germinal B細(xì)胞的百分比最高，表明兩種腫瘤對(duì)這一特定治療組合的反應(yīng)具有共同的行為（圖5C）。

圖5 4T1和EMT6中B-like細(xì)胞的亞聚類(lèi)分析

結(jié)論：

作者對(duì)免疫TME的精細(xì)表征可作為新研究的資源，旨在改善TNBC患者的治療選擇。