線粒體和鐵死亡——GPD2協(xié)同線粒體GPX4抵御鐵死亡
我們對細胞器抵御鐵死亡的機制了解甚少，這阻礙了我們在疾病治療中通過靶向鐵死亡達到治療目的。本研究通過代謝組分析發(fā)現(xiàn)GPX4抑制劑處理后導致細胞中的甘油（G3P）丟失。進一步研究大小補充G3P的癌細胞以G3P脫氫酶2 (GPD2)依賴的方式減弱由GPX4抑制劑誘導的鐵死亡，GPD2缺失使得癌細胞對GPX4抑制引起的線粒體脂質過氧化和鐵死亡敏感，并且GPX4和GPD2同時敲低能協(xié)同抑制鐵死亡引起的腫瘤生長。這些結果表明GPD2參與線粒體抵御鐵死亡。本研究于2022年6月發(fā)表在《Proc Natl Acad Sci USA》IF：12.779期刊上。
技術路線：
主要實驗結果：
1、代謝組分析發(fā)現(xiàn)GPD2與鐵死亡調控關聯(lián)
在GXP4急性失活即用GPX4抑制劑處理后的2小時來挖掘鐵死亡的抵御機制。代謝組分析發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞用GPX4抑制劑（RSL3，ML210，ML162）處理2小時后 C-Asp，一種嘧啶生物合成的中間產(chǎn)物，是最顯著下調的，此外還發(fā)現(xiàn)G3P也在3種抑制劑處理的癌細胞中顯著下降了（圖1A-D）。而G3P補充顯著抑制RSL3誘導的不同癌細胞系的鐵死亡（圖1E）。這表明G3P具有抵御GPX4失活引起的鐵死亡的能力。
于是進一步探究G3P關聯(lián)鐵死亡調控的代謝酶，如圖1F所示，線粒體內膜結合的GPD2將G3P轉換回DAP，并將電子傳遞給線粒體中的電子傳遞鏈。Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)GPD2的表達而非GPD1，GPD1L，GK，PGP與細胞對GOX4抑制劑抗性相關（圖1G-H）。因此，后續(xù)研究關注GPD2。
圖1代謝組分析發(fā)現(xiàn)GPD2與鐵死亡調控關聯(lián)
為了探究GPD2在鐵死亡調控中的作用，采用CRISPR-Cas9方法分別在宮頸癌HeLa細胞，皮膚癌RPMI7951細胞，和大腸癌HCT116中敲低GPD2的表達，結果發(fā)現(xiàn)GPD2敲低不影響基底細胞活力但使得這些癌細胞對GOX4抑制劑誘導的細胞死亡和脂質過氧化敏感（圖1J-1S）。在HeLa和RPMI7951細胞中，細胞死亡被鐵死亡抑制劑ferrostatin-1或鐵螯合劑（DFO）完全抑制，證實這些GPX4抑制劑誘導了這些細胞系的鐵死亡（圖1K, L, N, O），然而HCT116細胞在用ferrostatin-1或DFO處理后仍有殘留死亡（圖1M, P），表明這些GPX4抑制劑主要觸發(fā)鐵死亡，但也可誘導HCT116細胞的其他非鐵死亡的細胞死亡。此外，GPD2缺失似乎不影響GPX4、FSP1、dhdh、SLC7A11、ACSL4等其他鐵死亡調控因子的表達（圖1I）。最后，研究顯示G3P抵御RSL3誘導細胞死亡的保護作用被GPD2敲除所廢止（圖1T-W）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明G3P通過GPD2和GPD2缺乏使細胞對GPX4抑制引發(fā)的鐵死亡敏感保護細胞免受GPX4抑制引起的鐵死亡。
圖2 GPD2敲除促進GPX4失活誘導的鐵死亡
GPD2是定位在線粒體內膜上的酶。分級分析證實了內源性GPD2在幾種癌細胞系中的線粒體定位（圖3A）。與此前的研究一直，MitoPerOx染色顯示RSL3處理不導致強烈的線粒體脂質過氧化，重要的是，GPD2敲低顯著增強RSL3處理下的線粒體脂質過氧化（圖3B-E）。野生型GPD2在GPD2敲除細胞中的恢復，而不是其線粒體定位缺陷的突變體(42AA)，挽救了GPD2缺陷對RSL3誘導的細胞死亡和線粒體脂質過氧化的影響（圖3A，F(xiàn)-L）。此外，在GPD2野生型細胞中，使用自由基捕獲抗氧化劑TEMPO或ferrostatin-1處理完全抑制了RSL3誘導的細胞死亡，但使用Mito-TEMPO不能提供任何保護作用（圖3M-P）。相反，在GPD2-KO細胞中，Mito-TEMPO和ferrostatin-1及TEMPO的作用類似，可以完全抑制RSL3誘導的線粒體脂質過氧化（圖3Q-S），并顯著抑制細胞死亡（圖3T-W）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明GPD2抑制線粒體脂質過氧化，而RSL3在GPD2缺陷細胞中誘導的鐵死亡至少部分是由線粒體脂質過氧化引發(fā)的。
接下來探究GPD2抑制線粒體脂質過氧化和鐵死亡的機制。分析發(fā)現(xiàn)GOD2敲除使細胞對GOX4抑制劑RSL3和ML210敏感（圖2J-P），但是對另一種鐵死亡抑制劑FIN56，其可耗竭CoQ和GPX4（圖4A-D）。由于GPX4抑制劑和FIN56之間的主要區(qū)別在于它們對CoQ耗盡的影響不同，這些數(shù)據(jù)表明GPD2以CoQ依賴的方式抑制鐵死亡（例如，當CoQ被FIN56耗盡時，GPD2敲除對鐵死亡的作用就減弱了）。與此一致，作者發(fā)現(xiàn)在用4-氯苯甲酸（4CBA）處理阻斷CoQ合成的條件下， GPD2敲除的鐵死亡敏感效應被消除（圖4E-F）。同樣地，COQ2缺失消除了GPD2缺失對RSL3誘導的鐵死亡的敏感作用（圖4G-H）。這些結果與已知的CoQ抑制脂質過氧化和鐵死亡作用相符。在線粒體內膜中，GPD2將G3P氧化為DAP，并將CoQ還原為CoQH2（圖1F）。作者證實GPD2敲除導致HeLa 和HCT116e細胞中CoQ/CoQH2比例顯著增加（圖4I-J）。此外，補充MitoQH2（線粒體靶向CoQH2）完全抑制了RSL3處理的GPD敲除細胞的線粒體脂質過氧化（圖4K-M）并廢除了GPD2導致的鐵死亡敏感性（圖4N-P）。這些數(shù)據(jù)表明在線粒體中GPD2通過還原CoQ至CoQH2抑制脂質過氧化和鐵死亡。
近來的研究表明，F(xiàn)SP1和DHODH分別通過在質膜和線粒體中產(chǎn)生CoQH2來抑制鐵死亡。因此，作者進一步探究GPD2與DHODH或FSP1在調控鐵死亡中的相互作用。過表達DHODH而非FSP1，可以顯著挽救GOD2缺失細胞的鐵死亡敏感表型（圖4Q-R），此外，GPD2過表達可以部分挽救DHODH缺失細胞的鐵死亡敏感表型（圖4U-V）。GPD2 與線粒體中的 DHODH 并行運行，但不與質膜上的 FSP1 并行運行，以防止鐵死亡。
圖4在線粒體中GPD2通過還原CoQ至CoQH2抑制鐵死亡
5、在體外細胞模型中GPD2與線粒體GPX4協(xié)同作用抑制鐵死亡
上述結果促使作者繼續(xù)研究鐵死亡調控中GPD2和GPX4互作。為此，利用CRISPR-Cas9方法構建了GPD2和GPX4單敲除（KO）和雙敲除（DKO）的HCT116細胞（圖5A）。研究顯示GPX4-KO HCT116細胞在無ferrostatin-1培養(yǎng)基中長時間培養(yǎng)(14 ~ 15 d)后完全死亡（圖5B）。GPD2缺失不影響GPX4野生型細胞的活力，但顯著加速了GPX4-KO細胞的死亡，如在無ferrostatin-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后大部分DKO細胞死亡（圖5B-D）。值得注意的是，ferrostatin-1能完全抑制GPX4遺傳消融引起的HCT116細胞死亡，卻不能改變RSL3處理引起的死亡，說明RSL3具有脫靶效應，導致HCT116細胞非鐵死亡性細胞死亡（圖2M vs 圖5B-D）。一致地，DKO細胞的脂質過氧化水平明顯高于GPX4-KO細胞（圖5E）。在去除ferrostatin-1后，DKO細胞而非單KO細胞表現(xiàn)出強烈的線粒體脂質過氧化（圖5F）。
有幾種 GPX4 亞型具有不同的亞細胞定位，包括細胞溶質和線粒體 GPX4。 作者在GPX4-KO或DKO細胞中恢復細胞溶質或線粒體GPX4，分級分析證實，細胞溶質和線粒體GPX4正確定位于各自的隔室（圖5G）。隨后發(fā)現(xiàn)，過表達細胞溶質GOX4而非線粒體GPX4顯著抑制了GPX4-KO細胞的脂質過氧化和鐵死亡（圖5H-I）。與此形成鮮明對比的是，細胞溶質GPX4未能抑制DKO細胞的鐵死亡性細胞死亡（圖4J），而線粒體GPX4的過表達顯著推遲了DKO細胞的死亡，并且這種DKO細胞的死亡動力學與線粒體GPX4恢復似乎與GPX4-KO 細胞的恢復相似（圖5B vs圖5J）。ferrostatin-1后的第5天（在DKO細胞經(jīng)歷鐵死亡之前），線粒體GPX4的恢復顯著抑制了DKO細胞中總脂質過氧化或線粒體脂質過氧化的誘導，但胞質GPX4的恢復無抑制作用（圖5K-L）?？傊@些數(shù)據(jù)表明GPD2與線粒體GPX4平行作用，但不與胞質GPX4作用，以抑制線粒體脂質過氧化和鐵死亡。
圖5 GPD2與線粒體GPX4協(xié)同作用抑制細胞鐵死亡
6、GPD2與線粒體GPX4協(xié)同抑制腫瘤鐵死亡
最后作者在體內探究GPD2和/或GPX4失活是否通過誘導鐵死亡影響腫瘤生長。由于可獲得的GPD抑制劑（iGP-1）在本系統(tǒng)模型中無法發(fā)揮作用，并且沒有適用于動物模型的GPX4抑制劑，所以作者采用了基因學的方法解決該問題。注射對照、GPX4-KO、GPD2-KO、或DKO的HCT116細胞至裸鼠中，然后監(jiān)測腫瘤生長。結果發(fā)現(xiàn)GPX4-KO而非GPD2-KO顯著抑制腫瘤生長，然而DKO組表現(xiàn)出更顯著的腫瘤生長抑制，重要的是鐵死亡抑制劑liproxstatin-1處理幾乎完全恢復了DKO組腫瘤生長（圖6M-N）。進一步的分析顯示，盡管cleaved caspase-3和Ki67染色在不同基因型或處理之間沒有顯著差異，但脂質過氧化標記物4-HNE的表達，與對照組和GPD2-KO腫瘤相比，在DKO組水平更高，使用liproxstatin-1治療后，4-HNE染色水平完全恢復到對照組的水平（圖6O）。在DKO背景下，線粒體GPX4的恢復部分回復了腫瘤生長，同時恢復胞質和線粒體GPX4完全使腫瘤生長回復到與對照腫瘤相似的水平，而恢復細胞質GPX4或GPD2對腫瘤生長沒有影響（圖6P-Q）。這些體內結果支持了前面的體外研究，即GPD2與線粒體GPX4協(xié)同抑制腫瘤鐵死亡。
綜上所述，本研究證實GPD2通過在線粒體內膜生成CoQH2來抑制線粒體脂質過氧化，從而抵御細胞鐵死亡（圖6R）。
參考文獻：
Wu Shiqi., Mao Chao., Kondiparthi Lavanya., Poyurovsky Masha V., Olszewski Kellen., Gan Boyi.(2022). A ferroptosis defense mechanism mediated by glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 in mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A, 119(26), e2121987119. doi:10.1073/pnas.2121987119