ALKBH3依賴的Aurora A mRNA的m1A去甲基化抑制纖毛生成

初級(jí)纖毛是觸角狀的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，作為信號(hào)平臺(tái)，調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過程和胚胎發(fā)育。m¹A RNA修飾在RNA代謝和基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用；然而，m¹A修飾的生理功能在很大程度上仍不清楚。我們發(fā)現(xiàn)m1A去甲基化酶ALKBH3通過其去甲基化活性顯著抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞纖毛發(fā)生。機(jī)制上，ALKBH3去除纖毛發(fā)生的主抑制因子Aurora A mRNA上的m1A位點(diǎn)。ALKBH3的缺失增強(qiáng)了Aurora A mRNA的衰減并抑制其翻譯。此外，在斑馬魚胚胎中，ALKBH3突變體表現(xiàn)出纖毛缺陷，包括彎曲體、心包水腫、異常耳石和前腎管擴(kuò)張，野生型ALKBH3顯著拯救了這些缺陷，但其催化失活突變體卻不能。在脊椎動(dòng)物細(xì)胞和胚胎中，由ALKBH3耗盡引起的纖毛缺陷也被Aurora A mRNA的異位表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，依賴于ALKBH3的m1A去甲基化在Aurora A mRNA的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，這對(duì)脊椎動(dòng)物纖毛發(fā)生和纖毛相關(guān)的發(fā)育事件至關(guān)重要。本文于2022年3月發(fā)表于Cell Discovery (IF=38.079)上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

(1) ALKBH3通過依賴m¹A的方式抑制纖毛發(fā)生

為了研究m¹A RNA修飾在纖毛發(fā)生中的作用，我們首先在正常條件下使用小干擾RNA (siRNA)對(duì)人類RPE-1細(xì)胞中編碼m¹A調(diào)節(jié)蛋白的靶向基因進(jìn)行了功能篩選。TRMT6、TRMT61A或TRMT61B的缺失對(duì)RPE-1細(xì)胞纖毛發(fā)生沒有顯著影響(補(bǔ)充圖未展示)。用兩種siRNA中的一種沉默ALKBH1或TRMT10C對(duì)纖毛比例有影響。重要的是，用兩種不同的siRNA敲除ALKBH3顯著增加了纖毛細(xì)胞的百分比，但不影響纖毛的長度(圖1a-d)。此外，ALKBH3-FLAG蛋白的異位表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了ALKBH3敲除細(xì)胞中增強(qiáng)纖毛的作用(圖1e-g)。為了確認(rèn)ALKBH3在纖毛中的功能，我們外源表達(dá)了ALKBH3-FLAG，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)制表達(dá)ALKBH3- FLAG顯著減少了血清饑餓處理的RPE-1細(xì)胞的纖毛發(fā)生(圖1h-j)。

由于ALKBH3在mRNA上的去甲基化活性被D193A的突變所抑制，我們制備了一個(gè)催化不活躍的ALKBH3突變體(ALKBH3D193A)，以研究ALKBH3在纖毛發(fā)生中的調(diào)控是否依賴于它的去甲基化活性。通過LC-MS/MS對(duì)RPE-1細(xì)胞中m1A mRNA修飾的定量分析，證實(shí)我們構(gòu)建的ALKBH3-D193A結(jié)構(gòu)確實(shí)是催化活性不高的(補(bǔ)充圖未展示)。野生型ALKBH3-FLAG的異位表達(dá)顯著恢復(fù)了ALKBH3耗盡細(xì)胞的纖毛表型，但在RPE-1細(xì)胞中，突變型ALKBH3-D193A-FLAG的異位表達(dá)無效(圖1k-m)。此外，過表達(dá)的ALKBH3-D193A突變體對(duì)血清缺失的RPE-1細(xì)胞的纖毛沒有顯著影響(補(bǔ)充圖未展示)?？傊@些數(shù)據(jù)表明m1A RNA去甲基化酶ALKBH3在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起著纖毛發(fā)生的負(fù)調(diào)控作用。

圖1：ALKBH3通過其m¹A去甲基化活性抑制纖毛發(fā)生。

(2) 敲低ALKBH3導(dǎo)致Aurora A mRNA的m¹A水平升高

為了探索ALKBH3在纖毛發(fā)生中的分子機(jī)制，我們?cè)噲D確定被ALKBH3靶向的可能的mRNAs。首先，我們系統(tǒng)地分析了已發(fā)表的HEK-293T細(xì)胞中m1A-ID-seq和m1A-quant-seq的數(shù)據(jù)集，獲得了38個(gè)潛在的m1A修飾的轉(zhuǎn)錄本。這些潛在的m1A修飾的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步與來自CiliaCarta的纖毛蟲相關(guān)基因和在缺乏ALKBH3的RPE-1細(xì)胞中差異表達(dá)的RNA-seq基因重疊。結(jié)果，在這四個(gè)數(shù)據(jù)集中，只有Aurora A，一個(gè)主要的負(fù)調(diào)節(jié)因子，是重疊的(圖2a)。為了研究Aurora A mRNA上是否存在m1A位點(diǎn)，我們進(jìn)行了基因特異性甲基化RNA免疫沉淀qPCR試驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，在缺乏ALKBH3的細(xì)胞中，Aurora A mRNA的m1A豐度顯著增加(圖2b)，表明Aurora A mRNA可能包含m1A修飾。

為了確定Aurora A mRNA上的精確m1A位點(diǎn)，我們仔細(xì)分析了來自野生型和ALKBH3敲除HEK-293T細(xì)胞中的m1A-ID-seq數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)在Aurora A mRNA的翻譯起始區(qū)附近有潛在的m1A峰(圖2c)?？紤]到RT-1306是一種進(jìn)化的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠誘導(dǎo)RNAs上m1A位點(diǎn)的突變，我們使用RT-1306來識(shí)別Aurora A mRNA上的m1A位點(diǎn)。我們從對(duì)照細(xì)胞和ALKBH3缺失細(xì)胞的cDNAs中獲得的測序數(shù)據(jù)顯示，在Aurora A mRNA翻譯起始位點(diǎn)附近的編碼序列區(qū)存在3個(gè)m1A位點(diǎn)(圖2d)。此外，我們還將RT-1306擴(kuò)增的上述cDNAs進(jìn)行TA克隆，并選取單個(gè)菌落進(jìn)行測序分析。結(jié)果顯示，在缺乏ALKBH3的細(xì)胞中，這些m1A位點(diǎn)的突變率顯著增加(圖2e)。綜上所述，這些觀察結(jié)果表明，ALKBH3催化Aurora A mRNA上m1A位點(diǎn)的去甲基化。

圖2：ALKBH3去除Aurora A mRNA上的m¹A位點(diǎn)。

(3) ALKBH3促進(jìn)Aurora A mRNA的穩(wěn)定和翻譯

由于mRNA的m¹A修飾被報(bào)道影響mRNA的代謝過程，包括mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，我們首先研究了ALKBH3是否調(diào)節(jié)Aurora A的mRNA水平。結(jié)果顯示，敲低ALKBH3顯著降低了RPE-1細(xì)胞中Aurora A mRNA的水平(圖3a,b)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)細(xì)胞中使用放線菌素D暫停轉(zhuǎn)錄時(shí)，在缺乏ALKBH3的細(xì)胞中，Aurora A mRNA的衰減率也顯著增強(qiáng)(圖3c)。接下來，我們確定了Aurora A mRNA的RNA翻譯效率是否受ALKBH3的影響。Western分析表明，ALKBH3的缺失顯著降低了Aurora A蛋白水平，而異位表達(dá)的ALKBH3有效逆轉(zhuǎn)了這一變化，但突變體ALKBH3-D193A卻沒有改變(圖3d-g)。此外，RPE-1細(xì)胞中的多聚體分析顯示，穩(wěn)定敲除ALKBH3會(huì)導(dǎo)致高分子量(HMW)多聚體部分的Aurora A mRNA豐度降低，而這些多聚體通常具有較高的翻譯效率(圖3h,i)，這意味著ALKBH3的缺失可能會(huì)抑制Aurora A mRNA的翻譯?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，ALKBH3對(duì)Aurora A mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。

圖3：敲低ALKBH3會(huì)降低Aurora A mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力。

(4) ALKBH3通過Aurora A抑制纖毛發(fā)生

考慮到Aurora A是促進(jìn)纖毛分解的關(guān)鍵調(diào)控因子，我們推斷ALKBH3可能影響纖毛分解。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們用血清饑餓處理RPE-1細(xì)胞24小時(shí)以誘導(dǎo)纖毛，然后用血清再刺激24小時(shí)以觸發(fā)纖毛拆卸(圖4a)。在此條件下，我們觀察到對(duì)照組RPE-1細(xì)胞在血清刺激24小時(shí)后纖毛顯著減少(圖4b-d)。然而，缺乏ALKBH3的細(xì)胞明顯抵抗血清誘導(dǎo)的纖毛拆卸。因此，這些數(shù)據(jù)表明，ALKBH3具有調(diào)節(jié)纖毛拆卸的功能。我們的數(shù)據(jù)顯示，Aurora A的總水平在血清刺激后2小時(shí)略有上升，在18小時(shí)和24小時(shí)達(dá)到峰值(圖4e)。我們還發(fā)現(xiàn)在血清饑餓/再刺激期間，ALKBH3與Aurora A的表達(dá)模式相似(圖4e)。值得注意的是，在整個(gè)血清刺激過程中，缺乏ALKBH3的RPE-1細(xì)胞中的Aurora A蛋白水平明顯降低(圖4f)，這意味著ALKBH3對(duì)Aurora A表達(dá)的調(diào)控可能發(fā)生在纖毛周期中。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在缺乏ALKBH3的細(xì)胞中，Aurora A和磷酸化的Aurora A水平都明顯降低(補(bǔ)充圖未展示)。進(jìn)一步的結(jié)果表明，在缺乏ALKBH3的細(xì)胞中，中心體上Aurora A和磷酸化的Aurora A的熒光強(qiáng)度顯著降低(補(bǔ)充圖未展示)。中心體上Aurora A和磷酸化的Aurora A的細(xì)胞比例也顯著降低(補(bǔ)充圖未展示)。這些觀察結(jié)果表明，ALKBH3的消耗降低了中心體Aurora A和磷酸化Aurora A的水平。此外，Aurora A的沉默顯著促進(jìn)了RPE-1細(xì)胞的纖毛發(fā)生(補(bǔ)充圖未展示)。拯救實(shí)驗(yàn)表明，外源表達(dá)GFP-Aurora A蛋白能夠顯著逆轉(zhuǎn)由ALKBH3敲低引起的增強(qiáng)的纖毛(圖4g-i)。這些數(shù)據(jù)共同表明，ALKBH3通過促進(jìn)Aurora A的表達(dá)來抑制纖毛。

圖4：Aurora A的異位表達(dá)逆轉(zhuǎn)了ALKBH3缺失細(xì)胞的纖毛缺陷。

(5) ALKBH3缺乏促進(jìn)纖毛誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

為了探索缺乏ALKBH3的細(xì)胞中增強(qiáng)的纖毛是否與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)，我們首先檢測了無血清饑餓的RPE-1細(xì)胞中缺乏ALKBH3對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展的影響。FACS分析顯示，ALKBH3缺失增加了G0/G1期細(xì)胞的百分比(補(bǔ)充圖未展示)。免疫印跡分析顯示，在ALKBH3缺失的細(xì)胞中，細(xì)胞周期標(biāo)志物cyclin A減少，表明在ALKBH3敲低的細(xì)胞中，S期或G2/M期細(xì)胞減少(補(bǔ)充圖未展示)。進(jìn)一步的EdU-標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)ALKBH3耗盡時(shí)，EdU-結(jié)合細(xì)胞的百分比顯著下降(補(bǔ)充圖未展示)。這些數(shù)據(jù)表明，ALKBH3的耗盡導(dǎo)致細(xì)胞周期在G0/G1期停止。然后，我們研究了由ALKBH3耗竭引起的G0/G1期細(xì)胞周期阻滯是否由其增強(qiáng)的纖毛介導(dǎo)。來自FACS譜、細(xì)胞周期標(biāo)記和EdU合并的數(shù)據(jù)顯示，IFT20耗盡誘導(dǎo)的纖毛脫落顯著逆轉(zhuǎn)了ALKBH3耗盡細(xì)胞中G0/G1阻滯(補(bǔ)充圖未展示)，表明ALKBH3耗盡以纖毛依賴的方式誘導(dǎo)G0/G1阻滯。

接下來，我們研究了Aurora A敲除是否也會(huì)導(dǎo)致RPE-1細(xì)胞中纖毛依賴的細(xì)胞周期阻滯。Aurora A的沉默會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期在G0/G1期停止，同時(shí)IFT20的耗盡也會(huì)顯著逆轉(zhuǎn)(補(bǔ)充圖未展示)。總的來說，這些結(jié)果表明，無論是ALKBH3還是Aurora A的缺失都會(huì)導(dǎo)致RPE-1的纖毛增強(qiáng)，這可能隨后導(dǎo)致細(xì)胞周期在G0/G1期停止。

(6) 斑馬魚ALKBH3的分子特征

為了探索ALKBH3在脊椎動(dòng)物發(fā)育過程中纖毛發(fā)生中的作用，我們首先克隆了斑馬魚ALKBH3(圖5a)。生物信息學(xué)分析顯示，ALKBH3編碼一個(gè)推導(dǎo)出的282 aa蛋白，具有保守的2OG-Fe(II)加氧酶超家族域，這意味著斑馬魚的ALKBH3也可能具有去甲基化活性(圖5b)。比對(duì)分析表明斑馬魚ALKBH3與人類ALKBH3具有高度同源性(圖5c)。然后，我們檢測了斑馬魚ALKBH3在胚胎發(fā)育過程中的時(shí)間表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ALKBH3 mRNA由母體沉積，并在整個(gè)早期斑馬魚胚胎階段普遍表達(dá)(圖5d)。全安裝原位雜交顯示，ALKBH3 mRNA由母體提供，在48 hpf(受精后小時(shí))到72 hpf時(shí)在大腦中富集，在96 hpf時(shí)下降到低水平(圖5e)。

圖5：斑馬魚ALKBH3基因的分子特征。

(7) ALKBH3突變體在斑馬魚胚胎中顯示纖毛表型

為了研究ALKBH3是否影響斑馬魚的絨毛發(fā)生和胚胎發(fā)育，我們?cè)O(shè)計(jì)了反義嗎啉代寡核苷酸(ALKBH3 MO)來阻斷ALKBH3 mRNA的翻譯。ALKBH3突變體在斑馬魚胚胎中顯示出纖毛表型，包括身體彎曲、心包水腫、耳囊泡內(nèi)異常耳石和前腎管擴(kuò)張(圖6a-d)。重要的是，通過與ALKBH3 mRNA共注射，ALKBH3突變體中的這些缺陷被顯著逆轉(zhuǎn)，但根據(jù)氨基酸序列的進(jìn)化保守分析，預(yù)測到催化活性不強(qiáng)的ALKBH3突變體的ALKBH3-D185A mRNA沒有被逆轉(zhuǎn)(圖5b)。進(jìn)一步的觀察表明，在28 hpf時(shí)，與對(duì)照變體相比，ALKBH3突變體的前腎管纖毛明顯有缺陷，異位表達(dá)的ALKBH3 mRNA而不是異位表達(dá)的ALKBH3-D185A mRNA也顯著挽救了纖毛(圖6e,f)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，ALKBH3可能通過其在斑馬魚體內(nèi)的去甲基化活性在纖毛相關(guān)的發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖6：斑馬魚ALKBH3突變體表現(xiàn)出纖毛表型。

(8) Aurora A的異位表達(dá)逆轉(zhuǎn)了ALKBH3突變體的纖毛缺陷

為了確定Aurora A是否參與斑馬魚胚胎發(fā)育過程中ALKBH3對(duì)纖毛相關(guān)事件的調(diào)控，我們檢測了ALKBH3突變體中Aurora A mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Aurora A mRNA在缺乏ALKBH3的胚胎中顯著降低(圖7a)，這與我們從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得的數(shù)據(jù)一致(圖3b)。此外，共注射Aurora A mRNA能夠顯著逆轉(zhuǎn)ALKBH3突變體的纖毛表型(圖7b-e)。其他數(shù)據(jù)顯示，異位表達(dá)的Aurora A mRNA顯著挽救了ALKBH3敲除胚胎前腎導(dǎo)管的異常纖毛(圖7f,g)?？傊?，這些結(jié)果表明，ALKBH3可能通過調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)生中的Aurora A mRNA來影響纖毛相關(guān)的發(fā)育事件。

圖7：Aurora A的異位表達(dá)挽救了ALKBH3形態(tài)的纖毛缺陷。

結(jié)論：

我們的研究揭示了m¹A去甲基化酶ALKBH3在脊椎動(dòng)物纖毛發(fā)生和胚胎發(fā)育中先前未被描述的作用。ALKBH3在翻譯起始位點(diǎn)附近的編碼序列區(qū)去除Aurora A mRNA的m1A修飾，抑制Aurora A mRNA的衰變并促進(jìn)其mRNA的翻譯，從而維持Aurora A蛋白的豐度以抑制纖毛發(fā)生(圖7h)。

參考文獻(xiàn)：

Kuang, W., Jin, H., Yang, F., Chen, X., Liu, J., Li, T., Chang, Y., Liu, M., Xu, Z., Huo, C., Yan, X., Yang, Y., Liu, W., Shu, Q., Xie, S., & Zhou, T. (2022). ALKBH3-dependent m1A demethylation of Aurora A mRNA inhibits ciliogenesis. Cell discovery, 8(1), 25. https://doi.org/10.1038/s41421-022-00385-3.