一個(gè)新的tRNA衍生片段AS-TdR-007333通過HSPB1/MED29和ELK4/MED29軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展

肺癌是最常見的癌癥類型，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的85%。盡管近年來診斷和治療方法取得了長足的進(jìn)步，但NSCLC患者的總體5 年生存率仍不能令人滿意。盡管大量研究表明多種癌基因和抑癌基因參與了NSCLC的發(fā)病機(jī)制，但NSCLC致癌的分子基礎(chǔ)仍未完全闡明。因此，仍有必要探索NSCLC中未知的分子機(jī)制，以確定新的診斷和治療靶點(diǎn)。該研究發(fā)表于《Journal of Hematology & Oncology》，IF: 23.168。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 循環(huán)tRF在NSCLC患者術(shù)前和術(shù)后血漿樣本中的表達(dá)差異

為了識(shí)別和表征NSCLC中差異表達(dá)的循環(huán)tRF，作者比較了來自NSCLC患者的9對(duì)術(shù)前和術(shù)后血漿樣本之間的tRF表達(dá)譜。tRF和tiRNA測序顯示tRF表達(dá)譜在術(shù)前和術(shù)后血漿樣本之間存在顯著差異（圖1A）。循環(huán)tRFs的長度范圍為15至50個(gè)核苷酸（nt），其中 53.97%和30.11%的tRFs分別在20至23（nt）和31至33 nt之間（圖1B）。值得注意的是，術(shù)后血漿中大多數(shù) tRFs 的表達(dá)水平顯著低于術(shù)前血漿樣品中的表達(dá)水平（圖1B)，表明上調(diào)的血漿tRFs與NSCLC中腫瘤的存在有關(guān)。堆疊圖表明，通過切割成具有相同序列的片段，可以從不同的tRNA產(chǎn)生一種類型的tRF或tiRNA（圖1C, D)。餅圖分析顯示，大多數(shù)血漿tRF來源于tRNA的5'端。同樣，tiRNA系列更多地屬于tiRNA-5（圖1E, F)。

圖1 NSCLC患者血漿tRF譜的特征

2. tRF AS-tDR-007333在NSCLC中上調(diào)

在倍數(shù)變化≥2.0 和P ?< 0.05 的截止標(biāo)準(zhǔn)下，與手術(shù)后血漿樣品相比，作者在手術(shù)前血漿樣品中鑒定出4個(gè)上調(diào)的tRF和4個(gè)下調(diào)的tRF。其中AS-tDR-007333是一種新的tRF，以前在tRF數(shù)據(jù)庫中沒有報(bào)道過。AS-tDR-007333長28 nt，在tRNA-Gly-GCC的5'末端的位點(diǎn)1至28處切割。qRT-PCR檢測證實(shí)，NSCLC患者術(shù)前血漿中AS-tDR-007333的表達(dá)水平顯著（P?=0.0312）高于術(shù)后血漿樣本（圖2A）。在由NSCLC患者 (n=29) 和健康對(duì)照 (n=45) 的血漿組成的額外樣品組中的qRT-PCR分析顯示，NSCLC患者中的血漿 AS-tDR-007333 濃度顯著高于健康對(duì)照（圖2B）。接受者操作特征（ROC）分析表明曲線下面積（AUC）為0.9379（敏感性=97.78%，特異性=79.31%）（圖2C)，表明血漿AS-tDR-007333 水平具有作為NSCLC診斷生物標(biāo)志物的高潛力。此外，NSCLC細(xì)胞系（PC9、HCC827、NCI-H226和A549）中AS-tDR-007333的表達(dá)水平也高于正常人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）中的表達(dá)水平（圖2D)。此外，非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織（n=9）中AS-tDR-007333的表達(dá)水平顯著（P?<0.0001）高于相鄰正常組織（n=9）（圖2E)。綜合來看，多條證據(jù)明確表明 AS-tDR-007333在NSCLC中上調(diào)，可能在 NSCLC的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

圖2 tRF AS-tDR-007333在NSCLC中上調(diào)，并與NSCLC患者的較差預(yù)后相關(guān)

3. AS-tDR-007333的高表達(dá)與NSCLC預(yù)后不良有關(guān)

為了評(píng)估AS-tDR-007333在NSCLC患者中的臨床意義，作者使用FISH來確定NSCLC 腫瘤組織和鄰近組織中的 AS-tDR-007333 表達(dá)水平。結(jié)果表明，AS-tDR-007333 水平與TNM分期呈正相關(guān)（圖2F，H)，表明 AS-tDR-007333 水平與 NSCLC 的進(jìn)展有關(guān)。此外，AS-tDR-007333 在細(xì)胞質(zhì)中比在細(xì)胞核中更豐富（圖2G）。因此，使用AS-tDR-007333的細(xì)胞質(zhì)染色評(píng)分來評(píng)估AS-tDR-007333水平與NSCLC結(jié)局之間的關(guān)系。當(dāng)根據(jù) AS-tDR-007333 的細(xì)胞質(zhì)評(píng)分將患者分為兩組時(shí)（評(píng)分≥3，高表達(dá)；評(píng)分 < 3，低表達(dá)），Kaplan-Meier生存分析顯示，較高的AS-tDR-007333水平與NSCLC患者的總生存期 (OS) 較低（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，P=0.008，圖2I）。此外，多變量Cox回歸分析證實(shí)，AS-tDR-007333的較高表達(dá)與NSCLC中較短的生存時(shí)間顯著相關(guān)（HR = 2.288；95%CI，1.0203–5.1310；P?=0.04）。因此，臨床數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明較高的AS-tDR-007333水平與NSCLC患者的不良預(yù)后相關(guān)。

4. AS-tDR-007333 促進(jìn) NSCLC 細(xì)胞的增殖和遷移

為了評(píng)估AS-tDR-007333在NSCLC中的生物學(xué)功能，作者在NSCLC細(xì)胞中進(jìn)行了功能增益和功能喪失實(shí)驗(yàn)。CCK-8檢測顯示AS-tDR-007333的過表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，而 AS-tDR-007333的敲低顯著抑制NSCLC細(xì)胞增殖（圖3A-D）。為了檢查AS-tDR-007333對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的影響是否反映了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析以研究細(xì)胞周期進(jìn)程。結(jié)果表明，通過AS-tDR-007333過表達(dá)，PC9 細(xì)胞在S期停滯，而AS-tDR-007333 的抑制降低了S期細(xì)胞的比率（圖3E-H)。為了支持這些，在A549細(xì)胞中也觀察到了類似的結(jié)果（圖3I-L)。然后，作者使用transwell測定檢查了AS-tDR-007333在NSCLC細(xì)胞中的侵襲能力。作者發(fā)現(xiàn)AS-tDR-007333過表達(dá)組中遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，而 AS-tDR-007333 抑制劑逆轉(zhuǎn)了這些作用（圖3M-Q)。

圖3 AS-tDR-007333促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移能力

5. AS-tDR-007333通過上調(diào)MED29增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞增殖

為了探索受AS-tDR-007333調(diào)控的靶基因，作者將AS-tDR-007333轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中。RNA-seq分析顯示，過表達(dá)AS-tDR-007333的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組譜與NC細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜不同（圖4A, B)。在差異表達(dá)的基因中，MED29通過AS-tDR-007333過表達(dá)顯示出最高的上調(diào)（圖4C）?；虮倔w（GO）分析表明，差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞成分的介體復(fù)合物（MED）中（圖4D)?；蚣患治?(GSEA) 還顯示MED途徑基因，特別是MED29，在AS-tDR-007333過表達(dá)的細(xì)胞中富集。此外，非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中MED29的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（圖4E)。類似地，qRT-PCR 測定和蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)MED29基因和蛋白質(zhì)在NSCLC細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖4F）。有趣的是，AS-tDR-007333的表達(dá)水平與MED29在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)?？傊?，這些結(jié)果表明AS-tDR-007333誘導(dǎo)的MED29上調(diào)可能在NSCLC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

為了驗(yàn)證AS-tDR-007333和MED29在NSCLC中的關(guān)系，作者將AS-tDR-007333轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中。Western印跡和qRT-PCR分析表明，AS-tDR-007333的過表達(dá)顯著促進(jìn)了MED29的表達(dá)，而抑制AS-tDR-007333則降低了MED29的表達(dá)水平（圖4G)。此外，CCK-8分析顯示MED29的上調(diào)促進(jìn)了A549和PC9細(xì)胞中的細(xì)胞增殖（圖4H，I），而MED29 的敲低抑制了NSCLC細(xì)胞的生長速率（圖4J，K)。此外，拯救試驗(yàn)表明，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染 AS-tDR-007333相比，將AS-tDR-007333與si-MED29共轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中導(dǎo)致細(xì)胞增殖顯著降低，表明AS-tDR-007333的生物學(xué)功能部分依賴于MED29?？傊?，這些結(jié)果表明AS-tDR-007333促進(jìn)了MED29的表達(dá)，MED29 隨后作為癌基因增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞的增殖。

圖4 AS-tDR-007333通過上調(diào)MED29增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞增殖

6. AS-tDR-007333與表觀遺傳增強(qiáng)MED29轉(zhuǎn)錄的HSPB1相互作用

為了闡明AS-tDR-007333在NSCLC中發(fā)揮其生物學(xué)功能的機(jī)制，作者進(jìn)行了RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，然后在NSCLC細(xì)胞中進(jìn)行了質(zhì)譜分析（圖5A）。作者發(fā)現(xiàn)AS-tDR-007333 與幾種癌癥相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白沉淀，包括HSPB1、DHX9、ACTB、YBX3 和 ILF2（圖 5B）。其中，作者對(duì)HSPB1特別感興趣，因?yàn)镠SPB1具有最高的匹配分?jǐn)?shù)，并且據(jù)報(bào)道與NSCLC的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。使用抗HSPB1抗體的RIP測定證實(shí) AS-tDR-007333與內(nèi)源性HSPB1特異性結(jié)合（圖5C）。計(jì)算蛋白質(zhì)-RNA對(duì)接分析還表明HSPB1蛋白中的幾個(gè)氨基酸殘基對(duì)AS-tDR-007333結(jié)合至關(guān)重要（圖5D)。這些數(shù)據(jù)表明，AS-tDR-007333可能通過直接結(jié)合NSCLC細(xì)胞中的HSPB1發(fā)揮其生物學(xué)功能。

確定AS-tDR-007333是否可以通過與HSPB1相互作用來調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞增殖。作者首先檢測了HSPB1在NSCLC細(xì)胞系和BEAS-2B細(xì)胞中的表達(dá)水平。qRT-PCR和Western blot 檢測均一致顯示HSPB1在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于BEAS-2B細(xì)胞（圖 5E、F)。通過將si-HSPB1和AS-tDR-007333 共轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中的拯救實(shí)驗(yàn)表明，通過過表達(dá)AS-tDR-007333增加的細(xì)胞增殖能力可以被si-HSPB1顯著降低（圖5G-J)，表明 AS-tDR-007333對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的影響在功能上至少部分依賴于HSPB1。

由于AS-tDR-007333可以與HSPB1相互作用并增強(qiáng)MED29的表達(dá)，作者假設(shè) AS-tDR-007333可能通過調(diào)節(jié)HSPB1發(fā)揮其生物學(xué)功能，從而進(jìn)一步改變MED29的表達(dá)和功能。為了驗(yàn)證作者的假設(shè)，作者將AS-tDR-007333及其抑制劑轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)AS-tDR-007333的過表達(dá)增加了HSPB1基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，而 AS-tDR-007333 的敲低降低了 HSPB1 的表達(dá)（圖6A-D）。有趣的是，敲低HSPB1不僅抑制了HSPB1 的表達(dá)，還抑制了MED29的表達(dá)（圖6E, G)。Co-IP分析顯示HSPB1可以與NSCLC細(xì)胞中的MED29結(jié)合（圖6F)，表明HSPB1和MED29之間存在潛在的相互作用。使用熒光素酶測定的救援實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AS-tDR-007333的上調(diào)顯著增加了MED29的啟動(dòng)子活性，而AS-tDR-007333與si-HSPB1的共轉(zhuǎn)染降低了MED29啟動(dòng)子的活性（圖6H）。在功能上，將MED29和si-HSPB1共轉(zhuǎn)染到 NSCLC 細(xì)胞中顯著抑制了MED29對(duì)細(xì)胞增殖的影響（圖 6I，J）?？傊?，作者的結(jié)果表明AS-tDR-007333可以通過激活HSPB1-MED29相互作用來增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞增殖。

組蛋白修飾在基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。由于UCSC基因組瀏覽器顯示MED29啟動(dòng)子區(qū)域包含H3K4me1和H3K27ac，轉(zhuǎn)錄激活的組蛋白標(biāo)記，作者檢查了HSPB1表達(dá)是否可能影響MED29啟動(dòng)子中的組蛋白標(biāo)記表達(dá)。JASPAR 數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測，HSPB1的MED29啟動(dòng)子區(qū)域有幾個(gè)推定的結(jié)合位點(diǎn)。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與野生型細(xì)胞相比，si-HSPB1抑制了H3K4me1和H3K27ac的表達(dá)水平（圖 6K）。此外，ChIP-qPCR 測定表明 HSPB1 的敲低顯著降低了MED29啟動(dòng)子區(qū)域中的H3K4me1和 H3K27ac水平（圖 6L，M）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，AS-tDR-007333可能至少部分通過HSPB1介導(dǎo)的MED29啟動(dòng)子中的H3K4me1和H3K27ac修飾來促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。

圖5 AS-tDR-007333直接與NSCLC細(xì)胞中的HSPB1結(jié)合并相互作用

圖6 AS-tDR-007333激活HSPB1以調(diào)節(jié)MED29啟動(dòng)子區(qū)域中的H3K4me1和H3K27ac水平

7. AS-tDR-00733 通過激活 ELK4 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控上調(diào) MED29

由于HSPB1-MED29相互作用只能部分解釋MED29的表達(dá)，作者推測在 AS-tDR-007333相關(guān)的MED29表達(dá)調(diào)節(jié)中可能存在其他機(jī)制。因?yàn)橛腥颂岢鲛D(zhuǎn)錄因子 (TF) 可以靶向特定的MED亞基以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，作者推斷MED29轉(zhuǎn)錄可能受特定轉(zhuǎn)錄因子的影響。使用JASPAR和UCSC數(shù)據(jù)庫分析，作者發(fā)現(xiàn)MED29啟動(dòng)子包含轉(zhuǎn)錄因子ELK4的推定結(jié)合位點(diǎn)（圖7A）。為了評(píng)估ELK4對(duì)NSCLC的影響，作者將si-ELK4轉(zhuǎn)染到NSCLC 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)si-ELK4顯著抑制了NSCLC增殖（圖7B, C）。為了確定 AS-tDR-007333是否可能影響ELK4的表達(dá)，作者將AS-tDR-007333轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中。作者發(fā)現(xiàn)AS-tDR-007333的過表達(dá)顯著促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞中ELK4的表達(dá)水平（圖7D, E); 相反，抑制AS-tDR-007333顯著降低了ELK4的表達(dá)（圖7D, F)。救援實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了AS-tDR-007333在NSCLC細(xì)胞增殖中與 si-ELK4 功能性相互作用（圖7G，H）。為了研究ELK4是否可能直接影響 MED29 表達(dá)，作者進(jìn)行了ChIP-PCR測定，證實(shí)ELK4直接與MED29基因的預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合（圖7I）。熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示，與NC載體細(xì)胞相比，ELK4的過表達(dá)顯著增加了含有野生型結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因的熒光素酶活性（圖7J)。然而，在ELK4與MED29的突變啟動(dòng)子的結(jié)合上，沒有觀察到熒光素酶活性的顯著變化（圖7J)。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明AS-tDR-007333與ELK4相互作用以修改MED29啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。

圖7 AS-tDR-00733通過ELK4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)MED29

8. 靶向 AS-tDR-007333 抑制體內(nèi) NSCLC 細(xì)胞生長

鑒于AS-tDR-007333在NSCLC中充當(dāng)致癌tRF，作者假設(shè)抑制AS-tDR-007333可能對(duì)NSCLC具有治療作用。評(píng)估AS-tDR-007333抑制劑在體內(nèi)的治療效果（圖8A)，作者合成了針對(duì)體內(nèi)研究進(jìn)行了優(yōu)化修飾的AS-tDR-007333靶向抑制劑, 如圖8B、C所示。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，AS-tDR-007333-inhibitor組的腫瘤體積明顯小于NC或空白對(duì)照組，但在實(shí)驗(yàn)組之間沒有觀察到體重差異。此外，AS-tDR-007333抑制劑組的平均腫瘤重量顯著低于對(duì)照組（P < 0.01）（圖8D，E)。此外，與NC組和對(duì)照組相比，AS-tDR-007333抑制劑組異種移植腫瘤組織中AS-tDR-007333、HSPB1、ELK4和MED29的表達(dá)水平明顯受到抑制（圖8F-I)。此外，施用AS-tDR-007333抑制劑還抑制了異種移植腫瘤組織中 MED29 和 Ki-67 蛋白的表達(dá)水平（圖8J)。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明 AS-tDR-007333抑制劑可以通過抑制體內(nèi)MED29的表達(dá)來抑制NSCLC腫瘤的生長。

圖8 用抑制劑靶向AS-tDR-007333可減少體內(nèi)NSCLC腫瘤的生長

結(jié)論：

研究確定了一種新的致癌tRF，并揭示了AS-tDR-007333通過HSPB1-MED29和 ELK4-MED29軸促進(jìn)NSCLC惡性腫瘤的新機(jī)制。AS-tDR-007333是NSCLC的潛在診斷或預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

    示意圖顯示了AS-tDR-007333如何通過HSPB1-MED29和ELK4-MED29軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展

參考文獻(xiàn)：

Yang W, Gao K, Qian Y, Huang Y, Xiang Q, Chen C, Chen Q, Wang Y, Fang F, He Q, Chen S, Xiong J, Chen Y, Xie N, Zheng D, Zhai R. A novel tRNA-derived fragment AS-tDR-007333 promotes the malignancy of NSCLC via the HSPB1/MED29 and ELK4/MED29 axes. J Hematol Oncol. 2022 May 7;15(1):53. doi: 10.1186/s13045-022-01270-y. PMID: 35526007; PMCID: PMC9077895.