VEGF糖基化參與血管生成

N-糖基化和二硫鍵的形成是蛋白質(zhì)折疊的兩個(gè)重要步驟，它們發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中，相互影響。本研究為分析N-糖基化和氧化之間的相互作用，研究了蛋白質(zhì)二硫氧化酶ERO1-α如何影響血管生成VEGF121的糖基化，VEGF121是血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究揭示ERO1丟失對(duì)蛋白質(zhì)N-糖基化的影響不僅與血管生成有關(guān)，而且與其他癌癥病理機(jī)制有關(guān)。本研究于2022年10月發(fā)表在《Redox Biology》IF：10.787期刊上。

技術(shù)路線：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、ERO1敲除的細(xì)胞氧化能力減弱氧化鍵形成受損

為了跟蹤WT和ERO1 KO HeLa細(xì)胞中ER的氧化還原平衡，利用比例氧化還原傳感器ER定位的roGFP2。如圖1A所示，在WT和ERO1 KO細(xì)胞中，DTT刺激后ER roGFP2迅速減少；然而，在還原劑的洗脫過程中，ERO1 KO細(xì)胞表現(xiàn)出較慢的恢復(fù)速度，而WT細(xì)胞的氧化平衡恢復(fù)得很快，ERO1 KO細(xì)胞在40分鐘內(nèi)未達(dá)到WT細(xì)胞的氧化平衡基線值，這表明缺乏ERO1會(huì)損害ER的氧化平衡。

為評(píng)估ERO1缺失對(duì)ER中二硫鍵形成速率的影響，作者構(gòu)建了FLAG-VEGF121，它被組裝成二硫連接的同型二聚體（圖1B），并比較了在WT和ERO1 KO細(xì)胞中，在蛋白合成抑制劑CHX脈沖作用后，細(xì)胞內(nèi)形成二硫連接的同型二聚體的速率。結(jié)果顯示，F(xiàn)LAG-VEGF121在WT和ERO1 KO細(xì)胞中的積累程度相似；然而，雖然在WT細(xì)胞中二聚體是所有時(shí)間點(diǎn)的主要物質(zhì)，但在ERO1 KO細(xì)胞中，二聚體的生成速度較慢，單體在沖洗過程中積累，表明單體轉(zhuǎn)化為二聚體的速度較慢（圖 1C）。 因此，由ERO1損失引起的氧化平衡的改變轉(zhuǎn)化為 VEGF121 二硫鍵形成速率的損害。

圖1ERO1 KO細(xì)胞中氧化能力受損和VEGF¹²¹二硫鍵形成延遲

2、ERO1 KO細(xì)胞分泌的VEGF¹²¹無鏈內(nèi)二硫鍵的缺陷而是N75上高糖基化

為分析WT和ERO1 KO HeLa細(xì)胞分泌的FLAG-VEGF121，收集兩細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基，用N -乙基馬來酰亞胺（NEM）烷基化，然后用FLAG-M1抗體免疫沉淀。免疫沉淀采用非還原SDS-PAGE分析。經(jīng)考馬斯藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)WT細(xì)胞的FLAG-VEGF121有三個(gè)主要條帶，對(duì)應(yīng)于VEGF121的二聚體和寡聚體，而ERO1 KO細(xì)胞的FLAG-VEGF121只有兩個(gè)條帶，即一個(gè)微弱的寡聚體和一個(gè)比WT細(xì)胞分泌的慢的遷移二聚體（圖2A）。從凝膠中分離這些條帶，DTT還原并用碘乙酰胺（IAA）烷基化，這一處理導(dǎo)致二硫鍵中半胱氨酸被標(biāo)記，導(dǎo)致氨基甲基(CAM)富集，最后進(jìn)行nLC-ESI-MS/MS（圖2B）。裂解肽的質(zhì)譜顯示，WT和ERO1 KO分泌的FLAG-VEGF121在NEM和IAA肽烷基化方面沒有太大差異。例如，參與VEGF121鏈內(nèi)二硫鍵的C68只以氧化形式存在于WT和ERO1 KO細(xì)胞的VEGF121中；C102也參與VEGF121的鏈內(nèi)二硫鍵，在WT和ERO1 KO細(xì)胞的VEGF121中均以混合還原和氧化狀態(tài)檢測(cè)到，這表明在ERO1 KO細(xì)胞中FLAG-VEGF121的分子內(nèi)二硫鍵沒有缺陷（圖2B）。

使用NetNGlyc在線軟件預(yù)測(cè)VEGF121 氨基酸序列的共有序列 NIT 內(nèi)75號(hào)位處存在N-糖基化位點(diǎn)。因此，作者假設(shè)圖2A遷移較慢的條帶是N-糖基化的產(chǎn)物，并使用糖苷內(nèi)切酶對(duì)此進(jìn)行測(cè)試。如圖2C所示，WT和ERO1 KO細(xì)胞的FLAG-VEGF121對(duì)內(nèi)糖苷酶H （ENDO H）不敏感，但對(duì)肽- N -糖苷酶F （PNGase F）敏感，導(dǎo)致快速遷移的蛋白質(zhì)消失。這些結(jié)果表明，遷移較慢的多肽含有N -鏈寡糖，在高爾基體中已經(jīng)成熟，從而獲得了對(duì)EndoH的抗性。用PNGase F（一種酰胺酶）處理后，糖基化Asn殘基被脫酰胺。對(duì)WT和ERO1 KO細(xì)胞中FLAG-VEGF121二聚體和寡聚體的片段肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，然后用PNGase F酶切，證實(shí)天冬酰胺N75被糖基化，除了來自WT細(xì)胞的低聚物2（圖2D）。挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ERO1在限制糖基化中的作用。在 ERO1 KO 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ERO1或其高活性突變體ERO1C131A的表達(dá)質(zhì)粒，通過改變糖基化形式占總量的 80% 至 40%，拯救了ERO1 KO細(xì)胞分泌的FLAG-VEGF121的N-高糖基化（圖2E）。

圖2 ERO1 KO細(xì)胞分泌的VEGF¹²¹鏈內(nèi)二硫鍵和N-高糖基化

3、ERO1 KO細(xì)胞VEGF¹²¹的N75高糖基化導(dǎo)致分泌動(dòng)力學(xué)缺陷

接下來比較VEGF121在WT和ERO1 KO細(xì)胞的分泌動(dòng)力學(xué)，并研究N-高糖基化如何影響這一過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERO1 KO細(xì)胞分泌VEGF121的動(dòng)力學(xué)受損，在最后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到平臺(tái)期（圖3A）。為研究該損傷是否由于高糖基化，構(gòu)建一個(gè)突變體，其中N75被Gln殘基（N75Q）取代。發(fā)現(xiàn)VEGF121突變體在WT和ERO1 KO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)都沒有糖基化（圖3B）。值得注意的是，該突變體在WT和ERO1 KO細(xì)胞中的分泌動(dòng)力學(xué)相當(dāng)，而在ERO1 KO細(xì)胞中的分泌受影響較小（圖3C-3D），表明N75的高糖基化是ERO1 KO細(xì)胞中FLAG-VEGF121分泌受損的基礎(chǔ)。

圖3 ERO1 KO細(xì)胞分泌的VEGF¹²¹的N75高糖基化損害其其分泌動(dòng)力學(xué)

4、VEGF¹²¹在ERO1 KO細(xì)胞中仍具有受體能力但在缺氧條件下受體能力喪失

突變?yōu)镕LAG-VEGF121的C60 (C60S)或C68 (C68S)絲氨酸，分別參與鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵（圖1B），增加了WT細(xì)胞分泌的VEGF121的N-糖基化，表明VEGF中二硫鍵形成的受損改善了其N -糖基化（圖4A）。與未突變的VEGF121相比，WT細(xì)胞中C60的分泌不受影響，而C68的分泌受損60%（圖4A）。當(dāng)ERO1 KO細(xì)胞分泌兩種突變體C60和C68時(shí)，未觀察到高糖基化，表明ERO1缺失是VEGF121糖基化的主要影響。與相同細(xì)胞中未突變的VEGF121相比，ERO1 KO細(xì)胞中C60的分泌不受影響，而C68的分泌受損85%，WT細(xì)胞中C68的分泌受損更嚴(yán)重（圖4A）。

利用表面等離子體共振（SPR）來確定Aflibercept的不同形式VEGF121的相對(duì)解離常數(shù)（KD），這是一種親和力的測(cè)量方法，Aflibercept是人IgG1的Fc區(qū)與VEGF兩受體VEGFR1和R2之間的融合蛋白。結(jié)果表明，ERO1 KO細(xì)胞分泌的VEGF121對(duì)受體的親和力大約是WT細(xì)胞分泌的VEGF121的2倍（但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），但突變的VEGF121 C60S的親和力是WT細(xì)胞分泌的VEGF121 C68S的6倍，而突變的VEGF121 C68S則完全不與受體結(jié)合。表明，來自ERO1 KO細(xì)胞的VEGF121仍然具有受體活性，排除了其大規(guī)模氧化展開的可能（圖4B）。

在低氧條件下，WT細(xì)胞分泌的VEGF121在糖基化或分泌量方面與正常缺氧條件下分泌的VEGF121相比，差異可以忽略不計(jì)（圖4C）。此外，其KD在數(shù)量上與常氧條件下分泌的對(duì)應(yīng)物相似（圖4D）。相反，在缺氧條件下，ERO1 KO細(xì)胞中VEGF121的分泌量受到嚴(yán)重影響（圖4C），這表明在ERO1缺失的條件下，VEGF121的成熟和分泌特別依賴氧氣。此外，KD降低兩倍表明缺氧條件下ERO1 KO細(xì)胞VEGF121受體能力進(jìn)一步受損（圖4D）。

圖4 ERO1 KO細(xì)胞的VEGF¹²¹具有受體能力但在缺氧條件下其受體能力受損

5、VEGF¹²¹和STT3B之間加強(qiáng)的聯(lián)系導(dǎo)致ERO1 KO細(xì)胞的高糖基化

正如已經(jīng)觀察到的，在ERO1 KO細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)VEGF121以及分泌形式都是高糖基化的。然而，與分泌型VEGF121不同的是，N-糖基化的細(xì)胞內(nèi)形式對(duì)EndoH和PNGaseF都敏感（圖5A）。在WT和ERO1 KO細(xì)胞中，VEGF121對(duì)兩種內(nèi)糖苷酶的敏感性沒有差異，這表明在穩(wěn)定狀態(tài)下，兩種細(xì)胞系中大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)VEGF121都沒有通過高爾基體過渡。細(xì)胞內(nèi)FLAG-VEGF121 C68S和C68S的表現(xiàn)與WT細(xì)胞中高糖基化的分泌對(duì)應(yīng)物非常相似，與ERO1 KO中的原生形式?jīng)]有相關(guān)差異（圖5B）。為從分子層面深入了解VEGF121高糖基化的原因和/或后果，分析了VEGF121在WT和ERO1 KO細(xì)胞中的相互作用物。轉(zhuǎn)染VEGF121、VEGF121C60S和VEGF121C68S的WT和ERO1 KO細(xì)胞的蛋白裂解物用FLAG M1抗體免疫沉淀后SDS-PAGE電泳。在考馬斯藍(lán)凝膠中，可以看到貫穿泳道的一系列條帶（圖5C）。

圖5 在ERO1 KO和半胱氨酸突變體中細(xì)胞內(nèi)VEGF¹²¹高糖基化

對(duì)圖5C的每個(gè)泳道進(jìn)行單獨(dú)的切除和消化，將洗脫后的多肽進(jìn)行nLC-ESI MS/MS分析，從而鑒定出VEGF121相互作用分子。對(duì)ERO1 KO細(xì)胞中VEGF121、VEGF121C60S和VEGF121C68S相互作用分子的通路分析表明，主要富集至通過天冬酰胺進(jìn)行N-鏈糖基化的通路（圖6A）。研究發(fā)現(xiàn)，在ERO1 KO細(xì)胞中，含有硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的STT3B復(fù)合物亞基MAGT1與所有三個(gè)VEGF121相互作用（圖6B）?；诖耍髡邲Q定關(guān)注VEGF121C68S，因?yàn)镃68中的突變是最接近糖基化Asn的，因此，其糖基化應(yīng)該受MAGT1影響較小。免疫沉淀證實(shí)，VEGF121和VEGF121C68S在WT和ERO1 KO細(xì)胞中均存在MAGT1免疫反應(yīng)帶（圖6C）。用MAGT1-HA轉(zhuǎn)染的WT和ERO1 KO細(xì)胞的NEM烷基化允許在非還原免疫印跡上解析 MAGT1 的不同氧化還原形式。來自ERO1 KO細(xì)胞的MAGT1出現(xiàn)在大約52 kDa的緩慢遷移帶中，這在 WT 細(xì)胞中不可見，表明 MAGT1 在 ERO1 KO 細(xì)胞中的氧化還原介導(dǎo)的相互作用（圖6D）。在WT和ERO1 KO細(xì)胞中，MAGT1和STT3B的缺失導(dǎo)致VEGF121和VEGF121C68S的低糖基化，表明VEGF121及其突變體都是STT3B/MAGT1的底物（圖6E）。然而，VEGF121C68S（最接近天冬酰胺的半胱氨酸突變體）的N-糖基化對(duì) STT3B/MAGT1干擾不敏感。這些發(fā)現(xiàn)表明，ERO1缺失通過MAGT1增強(qiáng)了STT3B與VEGF121底物之間的相互作用，導(dǎo)致其N-高糖基化。

圖6 ERO1-KO細(xì)胞中VEGF¹²¹及其半胱氨酸突變體與MAGT1的相互作用增強(qiáng)

6、缺乏ERO1的乳腺腫瘤異種移植瘤顯示糖基化改變

為探究ERO1在腫瘤中的生理性影響，構(gòu)建ERO1缺失或未缺失的三陰性乳腺腫瘤模型。用兩種具有不同糖特異性的凝集素：小麥胚芽凝集素（WGA）和隔離素B4（IB4）對(duì)異種移植物切片進(jìn)行染色。結(jié)果如圖7所示，雖然IB4染色在兩種基因分化腫瘤中表現(xiàn)相似，但ERO1 KO細(xì)胞中的WGA染色平均比WT細(xì)胞高1.5倍，并在KO細(xì)胞中表現(xiàn)出斑片狀聚集模式。對(duì)這些腫瘤簇所占體積的定量分析顯示KO腫瘤與WT腫瘤相比增加了5倍，表明ERO1缺陷在調(diào)節(jié)糖基化方面具有廣泛的作用。

圖7 ERO1-KO乳腺腫瘤表現(xiàn)為N-高-糖基化蛋白模式

綜上所述，本研究證實(shí)ERO1缺失會(huì)導(dǎo)致較少的氧化ER氧化還原平衡。這導(dǎo)致 VEGF121中二硫鍵形成延遲，這有利于其N-高糖基化并增加MAGT1捕獲潛力，進(jìn)一步增加其在N75上的糖基化。這反過來減慢了ERO1耗盡細(xì)胞中生長(zhǎng)因子的分泌，如圖8所示。

圖5 機(jī)制模式圖

參考文獻(xiàn)：

Varone Ersilia., Chernorudskiy Alexander., Cherubini Alessandro., Cattaneo Angela., Bachi Angela., Fumagalli Stefano., Erol Gizem., Gobbi Marco., Lenardo Michael J., Borgese Nica., Zito Ester.(2022). ERO1 alpha deficiency impairs angiogenesis by increasing N-glycosylation of a proangiogenic VEGFA. Redox Biol, 56(undefined), 102455. doi:10.1016/j.redox.2022.102455