長鏈非編碼RNA LINC00518通過miR-335-3p/CTHRC1軸促進(jìn)肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移

在當(dāng)今社會，肺癌仍然位居全球腫瘤相關(guān)死亡的首位，其發(fā)病率以每年10%的速度穩(wěn)步上升。肺腺癌（LUAD）是肺癌的主要類型之一。因此，迫切需要探索LUAD的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥機(jī)制。長基因間非蛋白編碼RNA 518 (LINC00518) 被認(rèn)為會在LUAD中引起癌癥增殖和轉(zhuǎn)移。盡管如此，LINC00518在LUAD中的準(zhǔn)確作用和分子機(jī)制仍未確定。該研究發(fā)表于《Cell Death Discovery》，IF: 7.109。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. LINC00518在肺腺癌(LUAD)組織中上調(diào)，并作為預(yù)后因素發(fā)揮重要作用

為了篩選LUAD中潛在的致癌lncRNA，作者比較了從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的LUAD和正常組織中的lncRNA表達(dá)?；鹕綀D顯示了來自TCGA的LUAD中所有差異表達(dá)的lncRNA（圖1A）。然后作者使用COX和LASSO回歸分析所有差異表達(dá)的lncRNA。LASSO回歸的lambda模型如圖1B所示。作者選擇了最小的lambda，并選擇了39個lncRNA（圖1C）。接下來，作者檢測了39個lncRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LINC00518在肺腺癌組織中的表達(dá)更高，使用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）（圖1E）。為了驗證這一結(jié)論，作者分析了20個LUAD組織和癌旁組織樣本中的LINC00518水平，并發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果（圖1F）。作者分析了483名LINC00518高或低表達(dá)的LUAD患者的總生存期 (OS)、無病生存期 (DFS)、疾病特異性生存期 (DSS) 和無進(jìn)展生存期 (PFS)。關(guān)于LUAD進(jìn)展的集體結(jié)果表明，較差的預(yù)后與 LINC00518 的較高表達(dá)密切相關(guān)（圖1D)。

圖1 上表達(dá)的LINC00518是LUAD生存的一個危險因素

2. LINC00518的ceRNA

通常有報道稱，其他一些人類腫瘤的增殖是通過上游LINC00518控制的miRNA或mRNA來加劇的。為了探索哪些miRNA或mRNA在肺腺癌中同樣起作用，軟件Cytoscape (v3.6.0) 用于顯示關(guān)于LINC00518的ceRNA相互關(guān)系的視覺網(wǎng)絡(luò)（圖1G）。令人驚訝的是，miR-335-3p與LINC00518有很強(qiáng)的相關(guān)性，在作者之前的研究中發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的miRNA，miR-335-5p在LUAD中被下調(diào)。此外，許多研究預(yù)測miR-335-3p的靶基因是CTHRC1，該基因在LUAD中增加。通過這項工作驗證如下，預(yù)測的ceRNA網(wǎng)絡(luò)在LINC00518調(diào)節(jié)的 LUAD中顯示極可能的miR-335-3p / CTHRC1軸。

3. LINC00518敲低抑制LUAD細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，并阻止細(xì)胞周期

肺腺癌細(xì)胞（A549和H1299）表達(dá)的LINC00518水平高于人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）（圖2A）。在確定siRNA功效后，Cell Counting Kit-8測定和集落形成測定發(fā)現(xiàn)，與對照相比，LINC00518減少的細(xì)胞中的增殖顯著降低（圖2B，C）。接下來，作者可以使用傷口愈合和transwell檢測來分別測量LINC00518對LUAD細(xì)胞遷移和侵襲的影響（圖2D, E）。為了確定LINC00518敲低如何抑制LUAD細(xì)胞中的細(xì)胞增殖，作者通過Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 4.1.0軟件使用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了KEGG通路分析。結(jié)果表明，LINC00518可能對細(xì)胞周期和粘著斑至關(guān)重要（圖2F）。然后，作者通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到LUAD細(xì)胞中S期細(xì)胞的比例有效降低，而G0/G1期細(xì)胞比例有效地增加（圖2G)。

圖2 LINC00518的敲低抑制了細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并降低了活力

4. MiR-335-3p被LINC00518直接靶向，抑制LUAD細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲

首先，在A549和H1299細(xì)胞中，作者檢測了轉(zhuǎn)染miR-335-3p的LINC00518的表達(dá)。使用qRT-PCR檢測到LINC00518的水平與miR-335-3p的表達(dá)一致，在轉(zhuǎn)染miR-335-3p模擬物的細(xì)胞中下調(diào)（圖3A）。為了確保這一預(yù)測，作者接下來構(gòu)建了含有野生型和突變型 miR-335-3p 結(jié)合位點的LINC00518熒光素酶質(zhì)粒，如圖3B所示。此外，RIP檢測進(jìn)一步驗證了LINC00518和miR-335-3p之間的直接相互作用（圖3C)。

作者通過使用模擬物誘導(dǎo)LUAD細(xì)胞中miR-335-3p的過表達(dá)，并通過CCK-8測定和集落形成測定研究了它們對細(xì)胞生長的影響（圖3D, F）。為了確定miR-335-3p轉(zhuǎn)染在 A549/H1299細(xì)胞中的作用，進(jìn)行了傷口愈合試驗和transwell試驗，如圖3E，G。

圖3 LINC00518直接靶向miR-335-3p，促進(jìn)CTHRC1表達(dá)，而miR-335-3p抑制LUAD細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

5. CTHRC1受miR-335-3p調(diào)節(jié)并增加LUAD細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

通過qRT-PCR測定，對應(yīng)于miR-335-3p的CTHRC1水平在用miR-335-3p模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中下調(diào)（圖3H）。為了確定這一預(yù)測，作者構(gòu)建了CTHRC1野生型3'-UTR和CTHRC1 MUT 3'-UTR，并在A549和H1299細(xì)胞中進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因測定（圖3I)。

作者在A549和H1299細(xì)胞中建立了靶向CTHRC1的小干擾RNA (siRNA)。與具有低 CTHRC1表達(dá)的細(xì)胞相比，通過CCK-8和集落形成測定法測定的對照細(xì)胞的生長明顯得到促進(jìn)（圖4A、B）。此外，CTHRC1的敲低抑制了A549和H1299細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過傷口愈合和transwell測定顯示（圖4C，D）。流式細(xì)胞儀結(jié)果還表明，CTHRC1可以通過影響LUAD細(xì)胞的細(xì)胞周期來促進(jìn)增殖（圖4E)。

圖4 CTHRC1的敲低抑制了細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并降低了活力

6. CTHRC1可能影響整合素β3/FAK信號傳導(dǎo)，LINC00518可能是FAK抑制劑VS-6063的潛在協(xié)同治療靶點

首先，從TCGA數(shù)據(jù)庫下載LUAD中mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)，作者對CTHRC1和整合素的共表達(dá)進(jìn)行了分析（圖5A）。然后，將信息放入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行功能分析，包括來自TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，之前進(jìn)行的共表達(dá)分析，CTHRC1系數(shù)為0.3，P?<0.05，和選定的基因。可以看出，CTHRC1可以聚集在細(xì)胞周期和粘著斑通路中（圖5B）。為了確定CTHRC1是否可以影響整合素β3/FAK信號傳導(dǎo)，作者使用了蛋白質(zhì)印跡分析（圖5C）。通過整合素β3和CTHRC1的共免疫沉淀可以揭示LUAD細(xì)胞的內(nèi)源性整合素β3被CTHRC1抗體免疫沉淀（圖5D）。然后作者使用H-Score來判斷CTHRC1和整合素β3的表達(dá)。IHC染色結(jié)果顯示它們在組織中的表達(dá)存在相關(guān)性（圖5E）。

為進(jìn)一步探索該研究的臨床意義，作者檢測了FAK抑制劑VS-6063在A549和H1299細(xì)胞中的IC50，結(jié)果表明miR-335-3p抑制劑可以提高VS-6063的IC50（圖5G）。CCK-8測定還顯示，具有VS-6063（5μmol/L）的細(xì)胞具有顯著降低的增殖能力（圖5F，H）。此外，作者使用Transwell分析表明，當(dāng)miR-335-3p被抑制時，VS-6063可以抑制LUAD細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖5I）。VS-6063的藥物靶點FAK信號通過蛋白質(zhì)印跡分析誘導(dǎo)（圖5J)。

圖5 CTHRC1可以影響整合素β3/FAK信號

7. LINC00518在體內(nèi)LUAD細(xì)胞中的作用

首先，使用異種移植小鼠模型來確認(rèn)LINC00518在體內(nèi)LUAD細(xì)胞中的作用。如圖所示（圖6A，B)，由LINC00518敲低細(xì)胞形成的腫瘤在尺寸上明顯小于由對比細(xì)胞形成的腫瘤。根據(jù)這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)LINC00518敲低的細(xì)胞中的腫瘤重量更輕（圖6C）。接下來，作者從異種移植腫瘤中切除組織，并通過蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR對其進(jìn)行分析以驗證 LINC00518和CTHRC1（圖6D，E)。

圖6 敲除LINC00518可抑制體內(nèi)LUAD腫瘤生長

8. 下調(diào)miR-335-3p可逆轉(zhuǎn)LINC00518敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和集落形成的抑制作用

用sh-LINC00518轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞會降低細(xì)胞增殖，同時抑制miR-335-3p會逆轉(zhuǎn)這種作用（圖7A）。此外，通過集落形成試驗發(fā)現(xiàn)，LINC00518沉默細(xì)胞中的細(xì)胞存活能力顯著降低，而這種對細(xì)胞存活的負(fù)面印象可以通過miR-335-3p的低表達(dá)來逆轉(zhuǎn)（圖7B）。此外，Transwell分析表明，LINC00518 與調(diào)節(jié)LUAD細(xì)胞的侵襲和遷移有關(guān)，miR-335-3p 抑制劑逆轉(zhuǎn)了LINC00518敲低誘導(dǎo)的遷移和侵襲抑制（圖7C）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果還表明，敲低LINC00518對A549和H1299細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響可以被miR-335-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖7D）。通過蛋白質(zhì)印跡證實，敲除A549和H1299細(xì)胞中LINC00518的表達(dá)降低了CTHRC1 的蛋白質(zhì)水平，而miR-335-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)了這種作用（圖7E）。這種搜索的示意圖如圖8所示。

圖7 LINC00518通過miR-335-5p/CTHRC1軸促進(jìn)LUAD細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

結(jié)論：

該研究闡明了LUAD中細(xì)胞質(zhì)lncRNA LINC00518的臨床意義和生物學(xué)功能。LINC00518作為調(diào)節(jié)CTHRC1的分子海綿，通過整合素介導(dǎo)的粘著斑信號促進(jìn)LUAD生長和遷移。此外，LUAD樣本中LINC00518的表達(dá)高于正常，LINC00518的表達(dá)是LUAD患者預(yù)后的指標(biāo)。LINC00518 /miR-335-3p /CTHRC1軸可能會拓寬FAK抑制劑VS-6063在 LUAD中的應(yīng)用。該研究結(jié)果表明，LINC00518可以作為LUAD中FAK抑制劑的預(yù)后和協(xié)同治療靶點的有前途的生物標(biāo)志物。

圖8 本研究的模型

LINC00518/miR-335-3p/CTHRC1軸的模型受整合素β3/FAK信號通路的控制

參考文獻(xiàn)：

Shen R, Cai X, Shen D, Zhang R, Zhang W, Zhang Y, Li Y, Wang A, Zeng Y, Zhu J, Liu Z, Huang JA. Long noncoding RNA LINC00518 contributes to proliferation and metastasis in lung adenocarcinoma via the miR-335-3p/CTHRC1 Axis. Cell Death Discov. 2022 Mar 4;8(1):98. doi: 10.1038/s41420-022-00905-w. PMID: 35246517; PMCID: PMC8897435.