成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞去除和修復(fù)后的單細(xì)胞RNA測序

精子發(fā)生是一個(gè)高效、復(fù)雜和高度組織化的增殖和分化過程，它依賴于多種因素，包括間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的睪酮。盡管睪酮在精子發(fā)生中所起的關(guān)鍵作用已經(jīng)得到了很好的認(rèn)識，但其作用機(jī)制仍不完全清楚，部分原因是無法特異性和準(zhǔn)確地監(jiān)測發(fā)育中的生殖細(xì)胞內(nèi)對睪酮的依賴變化。目前，有研究首次提供了成年大鼠睪丸細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)。該研究發(fā)表于《SCIENTIFIC DATA》，IF：8.501。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

作者使用10x Genomics Chromium平臺構(gòu)建單細(xì)胞RNA-seq文庫，并在Illumina HiSeq PE150平臺進(jìn)行測序(圖1a)。實(shí)驗(yàn)包括四個(gè)睪丸治療組，覆蓋成年大鼠的一個(gè)完整的間質(zhì)細(xì)胞耗竭和替代周期。通過血清睪酮測定驗(yàn)證了乙烷二甲烷磺酸鹽(EDS)誘導(dǎo)的Leydig細(xì)胞消除(E1W)和再生(E3W和E7W)的過程(圖1b)。對于測序過程，飽和曲線分析表明，4個(gè)處理組的測序深度相當(dāng)，足以檢測到每個(gè)細(xì)胞中最多的基因(圖1c,d)。測序的詳細(xì)數(shù)據(jù)質(zhì)量指標(biāo)列于表1。所有治療組的總讀長均大于540 M。檢測到的有效條形碼在96.7% ~ 97.0%之間。基因組上的reads在87.3% ~ 97.3%之間，轉(zhuǎn)錄組上的reads在57.1% ~ 57.5%之間。4種治療的指標(biāo)非常相似，反映出由于技術(shù)原因引入的偏倚很小。

圖1 EDS處理和未處理的大鼠睪丸細(xì)胞的scRNA-seq分析

表1 FASTQ文件的詳細(xì)QC

基于細(xì)胞的詳細(xì)測序統(tǒng)計(jì)量列于表2以及圖1d。獲得的細(xì)胞數(shù)量估計(jì)在2,157 ~ 3,693個(gè)之間。每個(gè)細(xì)胞的中位UMI計(jì)數(shù)在36,562 ~ 55,914之間，每個(gè)細(xì)胞檢測的中位基因在4,586 ~ 5,297之間。除E7W組捕獲的細(xì)胞比其他組多外，其他4個(gè)處理組的這些指標(biāo)非常相似。線粒體轉(zhuǎn)錄本的百分比是細(xì)胞凋亡的粗略指標(biāo)，而血紅蛋白的百分比則是污染紅細(xì)胞的指標(biāo)。在這個(gè)的實(shí)驗(yàn)中，很少有細(xì)胞超過5%線粒體轉(zhuǎn)錄本和0.01% HB轉(zhuǎn)錄本這一常用閾值，表明純凈和活細(xì)胞的質(zhì)量高。總體而言，除E7W因組內(nèi)細(xì)胞數(shù)較多而檢測到的每個(gè)細(xì)胞的基因中位數(shù)略低外，其他指標(biāo)在4組間非常相似，反映出很少的技術(shù)差異。

表2 基于細(xì)胞的測序統(tǒng)計(jì)

為了進(jìn)一步比較4個(gè)治療組之間的數(shù)據(jù)一致性，通過PCA將各組的特征維度進(jìn)行降維，然后通過t-SNE在2個(gè)維度上進(jìn)行投影(圖1f)。令人驚訝的是，各組之間的細(xì)胞分布沒有顯著差異(圖1e)。因?yàn)椴G丸中各種生殖細(xì)胞群的RNA含量有很大的差異，在粗線精母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的水平最高 (圖1g和2)。包含可檢測基因最多的部分(圖1g，紅色箭頭)正是粗線精母細(xì)胞所在的區(qū)域(圖2a,c)。通過自動圖形聚類，作者發(fā)現(xiàn)了28個(gè)亞簇，這表明該數(shù)據(jù)集在生殖細(xì)胞發(fā)育階段的識別和表征、與各階段相關(guān)的新標(biāo)志物以及細(xì)胞間涉及的特定旁分泌因子方面具有豐富的潛力(圖1h)。

圖2 通過scRNA-seq鑒定的睪丸細(xì)胞類型的標(biāo)志物和屬性概述

為了顯示數(shù)據(jù)的質(zhì)量，根據(jù)圖形模式和預(yù)定義的集群數(shù)量對單元格進(jìn)行了初步的聚類。借助來自大鼠、小鼠和人類的睪丸細(xì)胞標(biāo)志物，作者能夠?qū)?8個(gè)基于圖的細(xì)胞簇合并為包含5個(gè)生殖細(xì)胞階段的7種主要細(xì)胞類型：精原細(xì)胞(SPG)、精母細(xì)胞(SPC)、圓形精子細(xì)胞(RSPT)、伸長精子細(xì)胞(ESPT)、濃縮精子細(xì)胞(CSPT)和2種體細(xì)胞類型Sertoli和Leydig(圖2a)。通過熱圖總結(jié)了每種細(xì)胞類型的前18個(gè)差異表達(dá)基因(圖2b)，其中5個(gè)代表性基因以名稱顯示。集群的一些特定標(biāo)記也顯示在t-SNE投影(圖2c)或小提琴分布(圖3a)。雖然大多數(shù)標(biāo)記只標(biāo)記一個(gè)特定的發(fā)育中的生殖細(xì)胞階段或特定的體細(xì)胞類型，但其他基因，如眾所周知的生殖細(xì)胞標(biāo)記物Ddx4，標(biāo)記了除凝集后期以外的整個(gè)生殖細(xì)胞群。此外，其他基因，如Crisp2或Rps16，在所有類型的睪丸細(xì)胞中普遍表達(dá)。

圖3 標(biāo)志基因和睪酮敏感基因的分布

作者又進(jìn)一步分析了每種細(xì)胞類型的知名標(biāo)記基因的表達(dá)模式(圖s7 ~ s8)。Dazl、Sohlh2和Elavl3是已知的SPG標(biāo)記，在本研究中，這些標(biāo)記只在聚類中表達(dá)(圖S7)。Phf、Id1和Ngfr在SPC中富集，Lrat和Spag在SPT中富集。Tnp和Prm都是眾所周知的標(biāo)記物。所有這些都被發(fā)現(xiàn)在本研究中對應(yīng)的聚類中特異性表達(dá)(圖S7, S8)。另外，兩個(gè)主要的體細(xì)胞群，Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞，只表達(dá)眾所周知的標(biāo)記物Clu和Gstm6的支持細(xì)胞和Cyp17a1和Cyp11a1的Leydig細(xì)胞。所有這些特異的表達(dá)標(biāo)記都支持細(xì)胞分類準(zhǔn)確的結(jié)論。

圖S7 不同睪丸細(xì)胞特異性表達(dá)基因的小提琴圖

圖S8 不同生殖細(xì)胞特異性表達(dá)基因的小提琴圖

另一個(gè)眾所周知的SPG干細(xì)胞基因是Gfra1。該基因并不是由SPG表達(dá)，而是由SPT高表達(dá)(圖S9A, B)。SPT在大鼠中高表達(dá)(圖S9C)。

圖S9 Gfra1在不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞中的表達(dá)

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)大鼠睪丸細(xì)胞的分類在多大程度上與最近對小鼠和人類睪丸細(xì)胞的研究一致，作者計(jì)算了在本次研究的前200個(gè)富集基因和已發(fā)表研究的基因列表中每種細(xì)胞類型的共享基因的數(shù)量。如補(bǔ)充表S1所示，該研究與Green等的研究在每種細(xì)胞類型的DEGs數(shù)量上是匹配的。體細(xì)胞的基因匹配率高于生殖細(xì)胞，發(fā)育晚期的生殖細(xì)胞基因匹配率高于發(fā)育早期。不同細(xì)胞類型之間共享的基因比相同細(xì)胞類型之間共享的基因要少得多。該研究和Hermann的小鼠和人類研究之間的所有細(xì)胞也是如此，但小鼠SPC除外(表S1和S2)。這些結(jié)果表明，除了小鼠SPC之外，3項(xiàng)研究中其他所有細(xì)胞類型都有很高的匹配度，這表明在不同物種的精子發(fā)生中有共同的發(fā)育和調(diào)控機(jī)制。

表S1 3項(xiàng)scRNA-Seq研究中睪丸主要細(xì)胞的前200個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)中共享的基因數(shù)量

表S2 2項(xiàng)scRNA-Seq研究中睪丸主要細(xì)胞的前200個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)中共享的基因數(shù)量

該研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是睪丸內(nèi)睪酮的耗竭和恢復(fù)。這樣一個(gè)動態(tài)的周期提供了一個(gè)機(jī)會來分析睪酮對維持和恢復(fù)精子發(fā)生的作用。為了檢測睪酮的缺失和恢復(fù)是否影響生殖細(xì)胞中任何基因的表達(dá)，比較4個(gè)治療組的基因表達(dá)(圖3b)。在1周(E1W)或3周(E3W)睪酮撤退時(shí)，Noxred1和Pdia5等基因被抑制(藍(lán)框)，但在7周(E7W)時(shí)恢復(fù)正常水平。有趣的是，Noxred1在第1周開始反彈，而Pdia5在第3周開始反彈，這表明可能涉及不同的調(diào)控機(jī)制。此外，這兩個(gè)基因的變化主要是在圓形精子細(xì)胞群體中，盡管這兩個(gè)基因的表達(dá)并不局限于該群體。除了生殖細(xì)胞，支持細(xì)胞對EDS處理的反應(yīng)中還有許多基因表達(dá)差異(圖3c)。有些基因在EDS治療后1和/或3周被完全抑制，到7周時(shí)完全恢復(fù)到control (C)水平。此外，在EDS治療后1周和/或3周，一些未被對照組表達(dá)的基因被激活。這些基因在EDS治療7周后被關(guān)閉。

總結(jié)：

這些數(shù)據(jù)集的主要分析進(jìn)一步支持了數(shù)據(jù)的質(zhì)量，以及探索新的生殖細(xì)胞特征、與特定發(fā)育階段相關(guān)的標(biāo)志物和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用中的旁分泌因子的潛力，特別是睪酮在精子發(fā)生中的作用。

用途：

該數(shù)據(jù)集可用于(1)在單細(xì)胞水平上識別和驗(yàn)證大鼠睪丸細(xì)胞中的新基因和轉(zhuǎn)錄本，(2)開發(fā)更全面的大鼠睪丸單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組注釋系統(tǒng)，(3)識別與大鼠精子發(fā)生特定階段相關(guān)的新基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及(4)發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中睪酮依賴的基因。