METTL3通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激增強宮頸癌的進展

        m6A是mRNA上最豐富的化學修飾，在許多生物過程中起著重要作用。然而，m6A在宮頸癌(CC)腫瘤發(fā)生中的作用尚不清楚。在這里，我們發(fā)現(xiàn)METTL3， m6A甲基轉(zhuǎn)移酶家族的核心成員，在CC中大幅上調(diào)。機制上，轉(zhuǎn)錄因子ETS1招募P300和WDR5分別介導METTL3啟動子中H3K27ac和H3K4me3組蛋白修飾，誘導METTL3轉(zhuǎn)錄激活。此外，我們通過MeRIP-seq確定了TXNDC5為METTL3介導的m6A修飾的靶點，并揭示了METTL3介導的TXNDC5表達依賴于m6A閱讀器依賴的方式。在功能上，我們通過體內(nèi)外實驗驗證了METTL3通過調(diào)節(jié)TXNDC5的表達促進CC細胞增殖和轉(zhuǎn)移。此外，我們的研究還驗證了METTL3/ TXNDC5軸對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響。綜上所述，METTL3促進了CC的惡性進展，提示METTL3可能是CC潛在的預后生物標志物和治療靶點。本文于2022年8月發(fā)表于“Oncogene”（IF=8.756）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）METTL3在CC中表達上調(diào)并與預后相關(guān)

   METTL3通常在大多數(shù)人類癌癥中起致癌基因的作用。為了研究METTL3在CC進展中的潛在作用，我們首先通過免疫組化染色確定了METTL3的表達。根據(jù)染色結(jié)果，正常組織中METTL3的表達水平低于CC組織(圖1A, B)。CC組織中IF染色結(jié)果顯示癌組織中METTL3的表達高于癌癥前期組織(圖1D)。為了檢測宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和CC組織中m6A的修飾水平，我們進行了IF、斑點雜交和m6A定量測定。結(jié)果顯示，與正常組織相比，CIN或CC組織中m6A含量顯著增加(圖1E-G)。METTL3高表達的CC患者總生存率明顯降低(OS，圖1C)。OS的單因素和多因素Cox回歸分析顯示，METTL3是CC患者的獨立預后因素(補充表，未展示)。以上數(shù)據(jù)證實，METTL3在CC組織中上調(diào)，與不良預后相關(guān)。

2）METTL3促進CC細胞在體外和體內(nèi)的增殖和轉(zhuǎn)移

   為了弄清METTL3在CC進展中的作用，我們在HeLa和SiHa細胞中過表達并沉默METTL3。過表達METTL3顯著促進細胞生長(圖2A，B)。細胞凋亡檢測結(jié)果表明，METTL3及其m6A催化活性抑制了細胞凋亡能力(圖2C)。為了驗證METTL3在體內(nèi)的作用，我們還構(gòu)建了腫瘤移植模型。統(tǒng)計結(jié)果顯示，METTL3明顯促進腫瘤生長(圖2E-G)。為了了解METTL3對CC轉(zhuǎn)移的影響，我們在體外進行了transwell試驗。我們的數(shù)據(jù)表明，METTL3促進了CC細胞的遷移和侵襲(圖2I)。為了進一步研究METTL3在CC惡性進展中的作用，我們進行了管形成實驗，發(fā)現(xiàn)METTL3在CC細胞中有更強的作用(圖2J)。Phalloidin染色顯示，METTL3過表達后CC細胞中絲狀肌動蛋白重組的侵襲性偽足發(fā)生了顯著變化(圖2H)，揭示了METTL3在CC細胞運動中的重要作用。接著，我們進一步闡明了METTL3在體內(nèi)CC轉(zhuǎn)移中的作用。通過裸鼠尾靜脈注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染METTL3和相應對照的HeLa細胞。4周后，METTL3過表達組肺轉(zhuǎn)移灶增加(圖2K, L)，以上實驗轉(zhuǎn)染效率參照圖2M。綜上所述，METTL3在體內(nèi)外均能促進CC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

3）ETS1通過P300介導的H3K27ac和WDR5介導的H3K4me3轉(zhuǎn)錄激活METTL3啟動子區(qū)

為了確定METTL3在CC中高表達的原因，我們通過UCSC基因組生物信息學網(wǎng)站分析了METTL3的啟動子。在METTL3啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量 H3K27ac和H3K4me3信號（補充圖）。因此，我們進行了染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試驗，驗證了H3K27ac和H3K4me3信號確實在METTL3的啟動子區(qū)富集(圖3A)。敲低P300和WDR5后，METTL3的蛋白水平顯著降低(圖3C)。Western blot分析顯示，C646和OICR-9429分別作為P300和WDR5的抑制劑處理后，METTL3蛋白減少，而NaBu作為組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砗?，METTL3蛋白增加(圖3B)。熒光素酶報告基因分析表明，P300和WDR5的敲除明顯削弱了熒光素酶的活性(圖3D)。這些觀察結(jié)果表明，P300介導的H3K27ac和WDR5介導的H3K4me3組蛋白修飾可能上調(diào)了METTL3。為了進一步研究METTL3在CC中上調(diào)的分子機制，我們結(jié)合不同轉(zhuǎn)錄因子預測網(wǎng)站的結(jié)果，在候選轉(zhuǎn)錄因子中， ETS1與CC的惡性進展相關(guān)，因此我們推測ETS1可能是METTL3的潛在轉(zhuǎn)錄因子。western blot結(jié)果顯示，METTL3、H3K4me3和H3K27ac的蛋白水平與ETS1呈正相關(guān)，而組蛋白H3的蛋白水平保持不變(圖3E, F)。RT-qPCR結(jié)果與western blot結(jié)果一致(圖3G)。我們推測ETS1招募了WDR5和P300，并與METTL3啟動子結(jié)合，介導其H3K4me3和H3K27ac組蛋白修飾，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。為了證實我們的猜想，我們確定了METTL3啟動子的結(jié)合基序和5個結(jié)合位點。ChIP分析驗證了ETS1與METTL3啟動子結(jié)合的5個位點(圖3I, J)。我們還構(gòu)建了含有結(jié)合位點突變的METTL3啟動子區(qū)域的熒光素酶報告基因質(zhì)粒，得到了相同的結(jié)果(圖3H)。IP檢測顯示ETS1和WDR5/ P300之間存在物理相互作用(圖3K)。為了驗證ETS1是否通過招募P300和WDR5來調(diào)節(jié)METTL3組蛋白修飾，我們進行了RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)沉默P300或WDR5減弱ETS1誘導的METTL3 mRNA水平(圖3L)。此外，ChIP分析結(jié)果顯示，沉默P300和WDR5降低了ETS1誘導的METTL3啟動子區(qū)H3K27ac和H3K4me3信號的富集(圖3M, N)。以上數(shù)據(jù)證實ETS1可能通過招募介導METTL3啟動子中H3K27ac和H3K4me3激活的P300和WDR5來上調(diào)METTL3。

4）METTL3誘導的m6A修飾是TXNDC5上調(diào)的原因

為了進一步探討CC惡性進展中與METTL3相關(guān)的分子機制，對轉(zhuǎn)染METTL3和Vector質(zhì)粒的HeLa細胞進行MeRIP-seq。m6A峰分布比例顯示，m6A峰主要分布在3'UTR、5'UTR、CDS和終止密碼子上(圖4A)。KEGG通路分析顯示CC中存在潛在的通路(圖4B，C)。我們發(fā)現(xiàn)METTL3過表達后，ER中的蛋白處理發(fā)生了很大的變化。有趣的是，在RNA-seq和MeRIP-seq數(shù)據(jù)中重疊前10的轉(zhuǎn)錄本中，TXNDC5是一種ER蛋白，它有助于蛋白質(zhì)的正確折疊(圖4D)。因此，我們認為TXNDC5是METTL3的靶點。然后我們通過western blot和RT-qPCR驗證了TXNDC5與METTL3在蛋白質(zhì)和RNA水平上的正相關(guān)性(圖4F-H)。同時，我們發(fā)現(xiàn)催化突變體METTL3對TXNDC5的上調(diào)比野生型要弱(圖4G, H)。突變效率通過斑點雜交試驗得到驗證(圖4E)。使用通用甲基化抑制劑DAA和m6A甲基化抑制劑Cyc阻斷CC細胞的甲基化，我們發(fā)現(xiàn)TXNDC5在蛋白質(zhì)和mRNA水平上均降低(圖4I, J)。MeRIP-qPCR顯示，在METTL3過表達后，TXNDC5的m6A水平顯著升高(圖4K)。總之，我們的數(shù)據(jù)證實了METTL3通過TXNDC5 mRNA的m6A甲基化促進TXNDC5。

5）METTL3通過m6a -reader依賴通路促進TXNDC5的表達

我們想知道m(xù)6A閱讀器是否參與了CC細胞中TXNDC5轉(zhuǎn)錄水平的變化。首先，我們通過western blot和RT-qPCR檢測YTHDFs和IGF2BPs對TXNDC5表達的影響(圖5B-D)，發(fā)現(xiàn)YTHDF1/2和IGF2BP2/3在TXNDC5的調(diào)控中起重要作用。RIP-qPCR結(jié)果提示YTHDF1/2和IGF2BP2/3可與TXNDC5 mRNA相互作用。這些數(shù)據(jù)揭示了YTHDF1/2和IGF2BP2/3在TXNDC5 mRNA上的潛在靶向作用。接下來，我們探討了m6A閱讀器對TXNDC5的調(diào)控機制。由于敲除YTHDF1后，TXNDC5 mRNA保持不變，蛋白表達降低，證明YTHDF1可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控TXNDC5。為了驗證這一點，我們用蛋白質(zhì)翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)處理METTL3穩(wěn)定干擾和相應對照的HeLa細胞。結(jié)果表明，METTL3敲減與對照HeLa細胞之間TXNDC5蛋白的半衰期相似(圖5A)，因此m6A甲基化與TXNDC5蛋白的穩(wěn)定性無關(guān)。因為翻譯調(diào)節(jié)是YTHDF1的重要功能之一。由于eIF3a/3b可通過與YTHDF1相互作用調(diào)節(jié)mRNA的翻譯，我們研究了eIF3a/3b對TXNDC5的影響。我們通過western blot排除了eIF3a/b對TXNDC5的影響(補充圖)。綜上所述，YTHDF1可能通過依賴m6A的方式促進TXNDC5 mRNA的翻譯。有報道稱m6A閱讀器可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，因此我們在CC細胞中檢測了METTL3過表達或m6A閱讀器抑制時TXNDC5 mRNA的穩(wěn)定性。我們發(fā)現(xiàn)，敲低IGF2BP2/3會降低TXNDC5 mRNA的穩(wěn)定性，而敲低YTHDF2則會增加TXNDC5 mRNA的穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明，IGF2BP2/3增強了TXNDC5 mRNA的穩(wěn)定性，而YTHDF2可能促進TXNDC5 mRNA的降解(圖5E)。同時，敲除這些閱讀器可以挽救METTL3對TXNDC5半衰期、mRNA和蛋白水平的影響(圖5F, H)。RIP-qPCR證實了閱讀器與TXNDC5 mRNA之間的相互作用(圖5G)。我們還研究了METTL3對YTHDF2表達的影響(圖5I)，這表明METTL3可能通過下調(diào)YTHDF2抑制CC中TXNDC5 mRNA的降解。綜上所述，說明METTL3通過m6A-reader依賴的方式調(diào)控TXNDC5的表達。

6）沉默的METTL3逆轉(zhuǎn)TXNDC5對CC細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

我們在有無si-METTL3的情況下過表達TXNDC5，發(fā)現(xiàn)TXNDC5有挽救作用(圖6A-C, I, J)，并且TXNDC5降低了si-METTL3增加的凋亡率(圖6D)。值得注意的是，除了血管生成實驗被完全拯救外，所有其他表型均顯示TXNDC5對si-METTL3的部分拯救。此外，TXNDC5的過表達逆轉(zhuǎn)了sh-METTL3對腫瘤生長的下調(diào)(圖6E-G)。METTL3和TXNDC5的下調(diào)可減少CC細胞的肺轉(zhuǎn)移。TXNDC5的過表達挽救了sh-METTL3對肺轉(zhuǎn)移的下調(diào)(圖6K)。IHC顯示sh-METTL3導致異種移植瘤組織中E-Cadherin水平升高，Ki-67、Vimentin和TXNDC5水平降低(圖6H)?？偟膩碚f，METTL3通過上調(diào)TXNDC5的表達促進CC的增殖和轉(zhuǎn)移。

7）METTL3通過TXNDC5減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的CC細胞死亡

為了研究METTL3/TXNDC5對CC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，TXNDC5在經(jīng)tunicamycin (Tm)處理或未處理的CC細胞中過表達。western blot結(jié)果顯示，METTL3和TXNDC5抑制了Tm處理的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物的上調(diào)(圖7A)。此外，我們發(fā)現(xiàn)過表達METTL3或TXNDC5會降低ROS水平(圖7C)。我們通過透射電鏡觀察到轉(zhuǎn)染了METTL3和TXNDC5的CC細胞亞細胞結(jié)構(gòu)中ER的腫脹減少了(圖7H)。為了研究TXNDC5對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響是否依賴于METTL3，我們進行了western blot，發(fā)現(xiàn)TXNDC5部分減弱了Tm處理的sh-METTL3引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物的上調(diào)(圖7B)。CCCP可作為ROS誘導劑。ROS檢測顯示TXNDC5挽救了Tm/CCCP處理下shMETTL3誘導的ROS水平(圖7D)。此外，TXNDC5過表達減少細胞凋亡和自噬(圖7E)。如圖7F所示，過表達TXNDC5后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡明顯減少。然后我們觀察到，與對照細胞相比，在Tm處理下過表達METTL3或TXNDC5的CC細胞顯示出MDC標記的囊泡數(shù)量顯著減少，而sh-METTL3導致相反的結(jié)果(圖7G)。TEM分析顯示，METTL3和TXNDC5與自噬體減少相關(guān)(圖7H)。這些結(jié)果表明，METTL3和TXNDC5均抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡和自噬。TXNDC5逆轉(zhuǎn)了sh-METTL3對Tm處理下MDC標記囊泡數(shù)量的影響(圖7I)。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3可能通過TXNDC5抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡和自噬。

結(jié)論：

我們的研究結(jié)果證實了METTL3在CC惡性進展中的致癌作用。機制上，ETS1將P300和WDR5招募到METTL3啟動子上，并通過維持H3K27ac和H3K4me3狀態(tài)促進其轉(zhuǎn)錄激活。我們還發(fā)現(xiàn)TXNDC5是METTL3的靶點，并指出了m6A閱讀器介導的機制。此外，METTL3通過上調(diào)TXNDC5促進CC細胞增殖和轉(zhuǎn)移，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡和自噬。ETS1/METTL3/TXNDC5/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激軸可能為CC的治療提供新的見解。

參考文獻：

Du QY, Huo FC, Du WQ, Sun XL, Jiang X, Zhang LS, Pei DS. METTL3 potentiates progression of cervical cancer by suppressing ER stress via regulating m6A modification of TXNDC5 mRNA. Oncogene. 2022 Sep;41(39):4420-4432. doi: 10.1038/s41388-022-02435-2.