23分文章揭示外泌體介導(dǎo)肺腺癌新機(jī)制

最近的研究表明，癌細(xì)胞除了消耗葡萄糖，可能還偏向腫瘤微環(huán)境中特定的能源物質(zhì)。然而，相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究強(qiáng)調(diào)靶向CAF特異性lncRNA以抑制谷氨酰胺流入和逆轉(zhuǎn)LUAD的腫瘤活性的治療潛力。LINC01614可能是LUAD的潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。本研究于2022年10月發(fā)表于期刊《J Hematol Oncol》（IF：23.168）。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、來自CAFs的外泌體包裝RNA增強(qiáng)谷氨酰胺的攝取和LUAD細(xì)胞進(jìn)展

作者首先驗證了CAFs（癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞）在LUAD（肺腺癌）中的作用。在LUAD的組織微陣列（TMA）中通過α-SMA免疫組織化學(xué)（IHC）染色鑒定活化成纖維細(xì)胞的數(shù)量（圖S1A）。與正常肺組織相比，α-SMA在LUAD中高度過表達(dá)（圖S1B）。α-SMA + CAF密度與T階段呈正相關(guān)（圖S1C）。α-SMA的高表達(dá)與較差的總生存期相關(guān)（圖S1D）。使用原代CAF和來自人LUAD樣品的配對正常成纖維細(xì)胞(NFs)進(jìn)行體外功能實驗（圖S1E-F）。作者建立共培養(yǎng)Transwell系統(tǒng)后，發(fā)現(xiàn)與CAFs共培養(yǎng)的LUAD細(xì)胞系（谷氨酰胺敏感的A549和谷氨酰胺不敏感的H1975）比單獨培養(yǎng)或與NFs共培養(yǎng)的LUAD細(xì)胞系表現(xiàn)出更高的增殖，遷移和入侵能力（圖S1G-I）。

為鑒定CAF介導(dǎo)的LUAD進(jìn)展的分子機(jī)制，作者進(jìn)行了RNA-seq分析，轉(zhuǎn)錄組的反應(yīng)體途徑分析和基因集富集分析（GSEA）顯示，在與CAFs共培養(yǎng)的A549細(xì)胞中，參與氨基酸和衍生物代謝的基因顯著上調(diào)（圖1A，B）。然后作者分別檢測在單獨培養(yǎng)的A549和與NFs和CAFs共培養(yǎng)的A549中線粒體耗氧率(OCR)和細(xì)胞外酸化率(ECAR)，線粒體活性和糖酵解的量度的變化，發(fā)現(xiàn)與CAFs共培養(yǎng)的LUAD細(xì)胞表現(xiàn)出更高的線粒體OCR和ATP合成（圖1C，D）。此外，作者通過代謝組學(xué)研究鑒定用指定外泌體處理的A549條件培養(yǎng)基中差異表達(dá)代謝物（圖1E）。隨后發(fā)現(xiàn)CAF衍生的外泌體顯著增強(qiáng)了線粒體OCR、谷氨酰胺消耗率、谷氨酰胺流入、ATP合成，來自谷氨酰胺分解代謝的TCA中間體的豐度以及LUAD細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（圖1F-K）。更重要的是，使用anti-CD31抗體消耗CAFs CM中的外泌體顯著抑制它們在促進(jìn)谷氨酰胺代謝和LUAD細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用（圖1F-K）。這些結(jié)果表明，CAF衍生的外泌體增強(qiáng)了谷氨酰胺的流入并促進(jìn)了LUAD細(xì)胞的發(fā)展。另外，作者觀察預(yù)處理的外泌體與RNase和Triton-X-100消除了CAFs對LUAD細(xì)胞的影響（圖1L-N）。這些數(shù)據(jù)證實來自CAFs的部分外泌體包裝RNA有助于增強(qiáng)谷氨酰胺代謝LUAD。

圖S1 CAFs促進(jìn)LUAD進(jìn)展，增強(qiáng)LUAD細(xì)胞的谷氨酰胺代謝

圖1來自CAFs的外泌體包裝RNA增強(qiáng)LUAD細(xì)胞中谷氨酰胺的攝取和進(jìn)展

2、特定于CAF的lncRNA LINC01614的驗證和轉(zhuǎn)移

為了證明CAF特異性lncRNA是否介導(dǎo)LUAD細(xì)胞的谷氨酰胺addicting，作者根據(jù)NJLCC隊列篩選了CAF特異性lncRNA。作者檢查了TCGA數(shù)據(jù)及其在外泌體中的存在，共納入149例非小細(xì)胞肺癌患者。為篩選CAF相關(guān)的lncRNA，首先進(jìn)行了一項分析，以基于TCGA LUAD數(shù)據(jù)集鑒定LUAD組織中過表達(dá)的lncRNA。發(fā)現(xiàn)649個lncRNA在LUAD組織中被上調(diào)(圖2A)。此外，作者基于NJLCC隊列和TCGA LUAD數(shù)據(jù)集確定195個lncRNA與TME群體的相關(guān)性。在195個與TME相關(guān)的lncRNA中，20個lncRNA與20種類型的LUAD基質(zhì)細(xì)胞高度正相關(guān)，包括兩種與CAFs高度正相關(guān)的lncRNA（LINC01614(ENSG000000230838和ENSG00000261327）（圖2B）。

qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，與LUAD細(xì)胞系、MRC5細(xì)胞（人胚肺成纖維細(xì)胞）和paired NFs相比，LINC01614而不是ENSG00000261327在CAFs中高表達(dá)（圖2C）。然后，作者通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）從LUAD組織中分離出CAFs，并且LINC01614而不是ENSG00000261327主要在CAFs中表達(dá)，而不在非CAF細(xì)胞中表達(dá)（圖2D）。鑒于CAF exosomal RNA增強(qiáng)了谷氨酰胺流入和LUAD的進(jìn)展，作者調(diào)查了LINC01614是否可以從CAFs中以外泌體的方式釋放。在RNase處理后，CAF CM中LINC01614的表達(dá)沒有改變，但是當(dāng)與RNase和Triton-X-100共孵育時LINC01614的表達(dá)顯著降低（圖2E），這表明LINC01614可以從CAF釋放，并且細(xì)胞外LINC01614主要被膜包裹而不是直接釋放。此外，與NFs相比，CAFs外泌體中LINC01614增加了五倍以上，在與CAF衍生的外泌體共培養(yǎng)的A549細(xì)胞中增加了三倍以上（圖2F）。qRT-PCR結(jié)果表明，與炎性CAF (iCAF) 和antigen-presenting CAF (apCAF)相比，LINC01614在肌成纖維細(xì)胞 (myCAF) 中過表達(dá)。

為確認(rèn)與CAF共培養(yǎng)的A549細(xì)胞中LINC01614的增加是否由外來體傳播引起，作者在共培養(yǎng)前分別敲除了CAFs中外切體分泌的關(guān)鍵酶LINC01614和RAB27，以消除LINC01614的釋放和外切體分泌（圖2G）。抑制外泌體分泌也抑制了與CAFs共培養(yǎng)的A549細(xì)胞中LINC01614的上調(diào)（圖2G）。重要的是，CAFs中的沉默LINC01614降低CAF外泌體中LINC01614的水平，而過表達(dá)LINC01614增加了CAF外泌體中的LINC01614水平（圖2G）。

此外，熒光原位雜交 (FISH) 和免疫熒光 (IF) 分析表明LINC01614在CAFs中過表達(dá)，并通過LUAD組織的α-SMA IF staining確定LINC01614的表達(dá)與CAF浸潤密度呈正相關(guān)（圖2H）。為進(jìn)一步確認(rèn)CAF衍生的LINC01614是否伴隨外泌體轉(zhuǎn)移，在與熒光標(biāo)記的A549細(xì)胞共培養(yǎng)之前，作者用5-ethynyl uridine (EU) 標(biāo)記CAF RNA。通過EU-modification with azide-linked fluorescein 評估，24小時后，A549細(xì)胞獲得CAF RNA（圖2I）。此外，當(dāng)CAF類似地用4-thiouridine (4sU) 標(biāo)記時，CAF CM處理導(dǎo)致LINC01614從CAFs轉(zhuǎn)移到A549細(xì)胞。相反，當(dāng)使用exosome inhibitor GW4869，外泌體從CM中耗盡時，LINC01614沒有轉(zhuǎn)移到A549細(xì)胞（圖2J）。這些數(shù)據(jù)表明CAF特異性lncRNA-LINC01614可以被釋放，并通過外泌體從CAFs轉(zhuǎn)移到LUAD細(xì)胞。

圖2 外泌體在CAF特異性lncRNA LINC01614細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移

3、CAF-exosome packed LINC01614是一種致癌lncRNA，通過上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白來增強(qiáng)LUAD細(xì)胞的谷氨酰胺攝取

敲低shLINC01614沉默CAFs中LINC01614，或擊倒RAB27抑制外泌體分泌都可以消除CAF誘導(dǎo)的LUAD細(xì)胞中谷氨酰胺的流入和利用（圖3A，B）。異位LINC01614表達(dá)增強(qiáng)了LUAD細(xì)胞中谷氨酰胺的利用（圖3C，D）。當(dāng)處理LUAD細(xì)胞時，來自LINC01614-silencing CAFs的外泌體抑制了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而來自CAFs的外泌體LINC01614異位表達(dá)促進(jìn)這些能力（圖3E，F(xiàn)）。此外，異位表達(dá)LINC01614還顯著促進(jìn)了LUAD細(xì)胞的惡化表現(xiàn)（圖3G，H）。接下來，作者研究了LINC01614對LUAD細(xì)胞進(jìn)展的相關(guān)作用是否與癌細(xì)胞的特異性谷氨酰胺addicting有關(guān)。結(jié)果表明，隨著補充的谷氨酰胺濃度的增加，A549和H1975細(xì)胞對谷氨酰胺的addicting日益增加。異位LINC01614的表達(dá)增強(qiáng)了LUAD細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲行為，但是當(dāng)谷氨酰胺被剝奪時，未能增強(qiáng)LUAD細(xì)胞的惡性行為（圖3I，K）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實了LINC01614促進(jìn)了對谷氨酰胺特異性上癮的LUAD細(xì)胞進(jìn)行的惡性進(jìn)展。沉默LINC01614減弱了SLC38A2和SLC7A5，而過表達(dá)LINC01614增強(qiáng)了CAF外泌體處理的A549細(xì)胞中的表達(dá)（圖3L，M）。此外，A549細(xì)胞中異位LINC01614的表達(dá)增強(qiáng)了SLC38A2和SLC7A5的表達(dá)（圖3N）。這些數(shù)據(jù)表明，CAFs通過外泌體傳遞CAF特異性lncRNA-LINC01614，增強(qiáng)了谷氨酰胺的流入和利用以及LUAD細(xì)胞的惡化表現(xiàn)。

圖3 CAF-exosome packed LINC01614通過上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白來增強(qiáng)LUAD細(xì)胞的谷氨酰胺攝取

4、LINC01614增強(qiáng)了ANXA2和p65的相互作用，促進(jìn)NF - κB的激活

FISH assays驗證LINC01614主要分布在CAF細(xì)胞質(zhì)中。Immunoblotting和RNA immunoprecipitation (RIP) assays證實p65 (Rela)和Annexin A2 (ANXA2)與LINC01614相關(guān)（圖4A，C）。此外，LINC01614與ANXA2可與p65共免疫沉淀（圖4D），提示LINC0164、ANXA2和p65可形成一個三元絡(luò)合物。LINC01614的加入，而不是反義的lncRNA，能有效地增強(qiáng)了p65和ANXA2之間的相互作用（圖4E）。為進(jìn)一步研究LINC01614與p65和ANXA2相關(guān)聯(lián)的片段，作者生成了一系列LINC01614的截短片段。RTCA和Boyden chamber實驗發(fā)現(xiàn)LINC01614的973-1775 nt與p65和ANXA2相互作用（圖4F）。此外，一個缺乏LINC01614莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸突變減弱了p65和ANXA2之間的相互作用（圖4G）。更重要的是，將LINC01614973-1775引入到含有重組p65和ANXA2的孵育系統(tǒng)中它們的相互作用增強(qiáng)了（圖4H）。

為闡明LINC01614介導(dǎo)的谷氨酰胺內(nèi)流的機(jī)制，作者對CAF外泌體處理的A549細(xì)胞的mRNA微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行了GSEA分析。一組核因子kappa B (NF-κB) 靶基因，IL-6、CCL5和CXCL10與CAF-exosome-treated A549細(xì)胞中LINC01614顯著共表達(dá)（圖4I），同樣，在用CAF外泌體處理的A549細(xì)胞中觀察到上調(diào)的NF-κb轉(zhuǎn)錄活性和增加的p65核易位，而在CAFs中敲除LINC01614未能激活NF-κb轉(zhuǎn)錄和p65核易位（圖4J-L）。此外，LINC01614的異位表達(dá)增加了A549細(xì)胞中的NF-κb轉(zhuǎn)錄活性和p65核易位（圖4M，O）?？傊@些結(jié)果表明CAF衍生的LINC01614增強(qiáng)了p65和ANXA2的相互作用并促進(jìn)了NF-κb的激活。

圖4 LINC01614增強(qiáng)了ANXA2和p65的相互作用，促進(jìn)NF - κB的激活

5、LINC01614促進(jìn)ANXA2依賴性p65磷酸化以及SLC38A2和SLC7A5的轉(zhuǎn)錄

為研究LINC01614激活NF-κb途徑的機(jī)制，作者評估了LINC01614對I κ Bα和IκB激酶（IKK）磷酸化的影響。然而，IKK和IκBα的磷酸化在A549細(xì)胞中不受異位LINC01614表達(dá)或CAF外泌體處理的影響（圖5A，B）。一致地，抑制NF-κB核易位 (JSH-23) 或沉默p65但不抑制IKK (BAY 11-7082)可以消除LINC01614對p65核易位的影響（圖5C）。從sh-LINC01614轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAF提取的外泌體減弱了Ser276處p65磷酸化的增強(qiáng)（圖5D）。此外，A549細(xì)胞中的LINC01614或ANXA2過表達(dá)顯著增強(qiáng)了Ser276處p65磷酸化（圖5E）。蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光染色和熒光素酶報告基因分析所揭示，沉默ANXA2減弱了LINC01614誘導(dǎo)的Ser276 p65磷酸化、p65的核保留和A549細(xì)胞中的NF-κ B活化（圖5F-H）。有趣的是，沉默p65降低了A549細(xì)胞中SLC38A2和SLC7A5的表達(dá)（圖5I）。作者接下來評估了NF-κB激活是否促進(jìn)了SCL38A2和SLC7A5的轉(zhuǎn)錄。JASPAR的序列分析表明，在SCL38A2和SLC7A5的啟動子上，NF-κB有典型的結(jié)合序列（圖5J）。重要的是，免疫沉淀(ChIP)分析和熒光素酶報告基因測定，分別確認(rèn)了SLC38A2和SLC7A5啟動子上的NF-κB結(jié)合位點。此外，編碼的芯片測序數(shù)據(jù)證實了基因組位置SLC38A2和SLC7A5啟動子上p65的峰（圖5M）。這些數(shù)據(jù)表明，CAF衍生的LINC01614與p65和ANXA2相互作用，并促進(jìn)Ser276處p65的ANXA2-induced磷酸化，從而導(dǎo)致LUAD細(xì)胞中兩個谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白SLC38A2和SLC7A5的轉(zhuǎn)錄的NF-κB活化。

圖5 LINC01614促進(jìn)了依賴于ANXA2的p65磷酸化和SLC38A2和SLC7A5的轉(zhuǎn)錄

6、CAF-衍生的LINC01614在體內(nèi)促進(jìn)LUAD腫瘤發(fā)生，是潛在的治療靶標(biāo)

異種移植腫瘤模型顯示，腫瘤內(nèi)注射CAF外泌體或共注射CAFs可促進(jìn)肺癌生長（圖6A，D）。來自shLINC01614轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAFs的外泌體抑制了異種移植物中的腫瘤生長，伴隨著Ki67，SLC38A2和SLC7A5的表達(dá)降低（圖6E）。此外，CAF外泌體治療促進(jìn)NCG(NODprkdc?/?IL-2Rg?/?)小鼠中LUAD細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，通過沉默CAFs中的LINC01614部分逆轉(zhuǎn)其轉(zhuǎn)移（圖6F）。此外，CAFs在斑馬魚體內(nèi)也表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移能力（圖6G-J）。然而，在共注射或外泌體提取前，在CAFs中沉默LINC01614會減弱轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞和CAFs的數(shù)量（圖6G-J）。

圖6 CAFs在外泌體中釋放LINC01614增強(qiáng)谷氨酰胺吸收和LUAD在體內(nèi)的進(jìn)展

7、LINC01614與谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白和LUAD患者生存率差相關(guān)

為證實本研究發(fā)現(xiàn)是否與臨床相關(guān)，作者在包含78對LUAD和鄰近正常組織的TMA中對α-SMA進(jìn)行免疫染色，分析了LINC01614表達(dá)與CAF浸潤的相關(guān)性，觀察到LINC01614在CAFs中大量表達(dá)。更重要的是，在78例具有豐富CAF浸潤的LUAD患者中，有37例在腫瘤細(xì)胞中顯示出增強(qiáng)的LINC01614雜交信號（圖7A）。腫瘤中LINC01614的CISH評分與CAF的密度呈正相關(guān)（圖7B）。LINC01614過表達(dá)與TNM隊列中T stage和TNM stage相關(guān)（圖7C，D）。Kaplan-Meier生存分析顯示，LINC01614的高表達(dá)與LUAD患者的不良總生存期相關(guān)（圖7E）。Cox比例風(fēng)險模型表明LINC01614是LUAD的獨立預(yù)后因素（圖7F）。

此外，作者對10例LUAD患者進(jìn)行SLC38A2、SLC7A5免疫染色，以α-SMA免疫染色表示CAF浸潤，將LINC01614的表達(dá)與腫瘤谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)聯(lián)。LINC01614在CAFs中富集，并且腫瘤細(xì)胞的LINC01614表達(dá)與α-SMA CAFs的密度以及腫瘤中SLC38A2和SLC7A5的表達(dá)呈正相關(guān)（圖7G）。此外，原代CAF中LINC01614的水平與配對的LUAD腫瘤細(xì)胞中SLC38A2和SLC7A5的mRNA水平呈正相關(guān)（圖7H，I）。這些臨床數(shù)據(jù)與實驗發(fā)現(xiàn)一致，即LINC01614從CAFs傳遞到LUAD細(xì)胞，從而增強(qiáng)LUAD中谷氨酰胺的攝取。

圖7 LINC01614與谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白和LUAD患者生存率差相關(guān)

結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CAFs通過上調(diào)LUAD中的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白而優(yōu)先促進(jìn)癌細(xì)胞對谷氨酰胺的成癮。本研究證明了LINC01614通過外泌體從CAFs釋放到LUAD細(xì)胞。在機(jī)制上，LINC01614直接與LUAD細(xì)胞中的ANXA2和p65相互作用，LINC01614是促進(jìn)NF-κB磷酸化和活化的支架。值得注意的是，NF-κB激活不是IKK和IκB磷酸化的結(jié)果，而是依賴于p65的翻譯后修飾。

參考文獻(xiàn)

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