APAF1結合長鏈非編碼RNA通過阻斷凋亡小體組裝促進胃癌的腫瘤生長和多藥耐藥

胃癌（GC）是全球第五大最常見的惡性腫瘤和第三大癌癥相關死亡原因，每年約有40% 的新病例和死亡發(fā)生在中國?；熑匀皇峭砥贕C治療的基石。然而，耐藥性和不可避免的嚴重毒性導致化療失敗。因此，迫切需要闡明更詳細的分子機制并確定GC治療的有效治療靶點。該研究發(fā)表于《ADVANCED SCIENCE》，IF: 17.521。

技術路線：

主要研究結果：

1. ABL在GC中上調并預測GC患者的預后不良

為了分析GC中的lncRNAs表達，作者首先通過RNA測序(RNA-seq)分析了來自GC患者的四對癌性和匹配的相鄰正常組織標本。代表性上調和下調的lncRNA（倍數(shù)變化>2或 <1/2，p值<0.05）顯示在熱圖中（圖1A）。有趣的是，兩個名為RP3-512B11.3(ABL)和 LOC730102的lncRNA被確定為進一步研究的熱門（圖1B）。接下來，作者利用癌癥基因組圖譜（TCGA）和生物信息學工具GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）的數(shù)據(jù)分析了選定的 lncRNA表達與GC預后之間的關聯(lián)，結果顯示GC患者ABL 表達較高的結果較差（p=0.024），而LOC730102表達與GC預后無顯著相關性（p=0.61）。因此，選擇lncRNA ABL作為進一步研究的候選者。

使用5'- 和3'- cDNA末端快速擴增 (RACE) 測定法來確定ABL的整個序列，確認在BGC-823細胞中檢測到的序列與存檔的ABL轉錄本(ENST00000561592)相同UCSC數(shù)據(jù)庫（http ://genome.ucsc.edu/）。隨后，通過qRT-PCR測定ABL在GC組織中的表達，表明與配對的相鄰正常組織相比，癌性GC組織中ABL表達顯著上調（圖1C）。進行了RNAscope和RNA熒光原位雜交(RNA-FISH)測定，證實了與GC組織中配對的正常胃粘膜細胞相比，GC細胞中ABL的顯著豐度（圖1D, E）。為了進一步研究ABL在GC中表達的臨床相關性，作者使用隊列1的組織微陣列進行了RNA-FISH測定，結果表明ABL在癌性GC組織中的表達遠高于匹配的正常胃組織（n=81，p=0.024；圖1F, G）。此外，Kaplan-Meier分析表明，ABL表達較高的GC患者總生存期降低（n=81，p=0.02968，對數(shù)秩檢驗；圖1H）。多變量Cox回歸分析表明ABL表達是GC患者預后的獨立預測標志物（圖1M）。為了進一步評估ABL表達的預測價值，作者進行了時間相關的受試者工作特征曲線分析。在隊列1中，臨床風險評分（TNM分期）和ABL風險評分的組合比單獨的評分更準確（圖1I）。例如，臨床風險評分在第5年的曲線下面積(AUC)為0.712，而臨床風險評分和ABL風險評分的組合顯著增加至0.889。此外，隊列1中的這些結果也得到了具有更多GC患者的獨立隊列（隊列2，n=192）的支持，這表明ABL表達在預后不良的GC患者中顯著增加（圖1J，K）。此外，單變量/多變量Cox回歸分析還顯示，T、N和M類別以及ABL表達與GC患者的生存率顯著相關（圖1N）。AUC還表明，在隊列2中，TNM分期和ABL風險評分的組合比單獨的評分更準確（圖1L）。總之，這些數(shù)據(jù)表明ABL表達在GC中顯著增加，并且ABL可能是GC患者的獨立預后因素。

圖1 ABL表達升高與GC患者的不良預后相關

2. ABL通過其WD1/WD2域直接綁定到APAF1

為了闡明ABL在GC中的功能作用，作者首先檢查了它的亞細胞定位。RNA-FISH分析顯示ABL主要位于細胞質中（圖2A）。為了鑒定ABL的蛋白質伙伴，體外轉錄的生物素化ABL有義和反義轉錄物經過lncRNA pull-down和質譜(MS)分析。值得注意的是，有義ABL轉錄本與APAF1特異性相關（圖2B）。然后，用細胞裂解物和RNA免疫沉淀(RIP)分析進行的RNA pull-down分析進一步證實了ABL與APAF1的特定關聯(lián)（圖2C, D）。此外，RNA-FISH結合免疫熒光(IF)顯示ABL和APAF1的細胞質共定位模式（圖2E）。為了確定負責APAF1結合的ABL序列基序，作者進行了體外RNA下拉，然后進行了如前所述的斑點印跡分析。由APAF1結合的ABL的基序序列被鑒定為包含nt 481-540（圖2F）。此外，使用重組APAF1進行的體外RNA蛋白結合試驗也證實ABL可以直接與APAF1相互作用，但ABL中相應序列（nt 481-540）的缺失完全消除了其與APAF1的相互作用（圖2G）。此外，蛋白質結構域作圖分析表明，ABL與APAF1 C末端氨基酸(aa) 613-1248的區(qū)域結合，包含15個WD40重復，構成兩個β-螺旋槳，分別稱為WD1 (aa 613-910)和WD2 (aa 922–1248) (圖2H，I）。WD40結構域是一個非經典的 RNA 結合基序，這與作者發(fā)現(xiàn)APAF1的 WD1/WD2 結構域作為ABL的RNA結合結構域是一致的。有趣的是，RNA-蛋白質對接分析還顯示，使用PDB2PQR服務器，ABL的nt 481-540區(qū)域與APAF1的WD1/WD2結構域完美相互作用（圖2J）?；谶@些結果，作者推測APAF1可能是一種RNA結合蛋白(RBP)，作者接下來進行了互補DNA末端的線性擴增和測序(LACE-seq)以證實這一假設。LACE-seq 鑒定的APAF1結合位點映射到2493個轉錄本（4662個結合峰），分布在編碼序列（CDS）、基因間區(qū)、內含子區(qū)、非編碼RNA（ncRNA）、3' 非翻譯區(qū)（UTR）, 和5' UTR (圖2K）。此外，作者發(fā)現(xiàn)APAF1在轉錄起始位點 (TSS) 周圍顯示出豐富的結合（圖2L）。同時，通過Multiple Em for Motif Elimination tool (MEME)分析APAF1結合基序（圖2M），并且“AACCUU_AG”共義序列可以映射到ABL轉錄本的481-540 nt中，與APAF1的 WD1/WD2 結構域相互作用。然后RIP-qPCR測定證實APAF1可以與LACE-seq中鑒定的mRNA或lncRNA顯著相互作用。其中，ABL比其他RNA更豐富（圖2N）?？偟膩碚f，這些結果表明ABL可以作為潛在的RBP直接與APAF1相互作用。

圖2 ABL直接與APAF1結合

3. ABL促進GC細胞存活并抑制多種藥物誘導的細胞凋亡

APAF1對內在途徑介導的細胞死亡至關重要，細胞死亡是由發(fā)育譜系信息、癌基因激活、DNA損傷和營養(yǎng)缺乏誘導的，并與化學抗性有關。因此，作者推測ABL通過與APAF1 結合來調節(jié)這一過程。首先，作者生成了穩(wěn)定的ABL敲低和ABL過表達的GC細胞（圖3A）。此外，ABL的敲低明顯抑制了超低附著培養(yǎng)板中GC細胞的生長，而ABL的上調則促進了細胞生長（圖3B，C）。然后，集落形成試驗表明，與相應的對照細胞的集落數(shù)相比，ABL缺陷細胞的集落數(shù)顯著減少，但ABL過表達細胞的集落數(shù)增加（圖3D-G）。此外，當細胞用指定劑量的順鉑 (DDP) 處理時，ABL缺陷細胞的集落數(shù)比對照細胞的集落數(shù)顯著減少（圖3D, E）。相反，與順鉑處理后的對照細胞相比，ABL過表達細胞的集落數(shù)顯著增加（圖3F, G）。作者進一步評估了ABL與5-Fu和PTX治療的這種效果。結果還支持以下結論：ABL的敲低加速了5-Fu和PTX誘導的細胞凋亡，而ABL的過表達促進了有或沒有5-Fu或PTX處理的細胞存活（圖3H-K）?？傊@些數(shù)據(jù)表明ABL促進GC細胞存活并可能參與多藥耐藥性。

圖3 ABL的敲低促進GC細胞凋亡和體外對多種藥物的敏感性

4. ABL通過競爭性阻斷Cyt c與APAF1的相互作用來拮抗GC細胞凋亡

為了進一步表征ABL調節(jié)細胞凋亡和化學抗性的機制，作者首先檢測了參與內在凋亡途徑的關鍵分子的蛋白質水平。ABL的上調降低了順鉑誘導的cleaved caspase-9/3的表達，但ABL的敲低增加了這種表達（圖4A）。然而，APAF1和Cyt c的蛋白水平沒有受到明顯影響（圖4A）。考慮到Cyt c夾在APAF1的WD1和WD2的兩個正面之間，這也是ABL結合域，作者詢問ABL與APAF1的結合是否競爭性地阻止了Cyt c與APAF1的相互作用。事實上，在用順鉑處理過的ABL過表達GC細胞中，APAF1與Cyt c結合的能力被顯著抑制（圖4B）。此外，作者發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比，用順鉑處理的ABL過表達細胞中APAF1和Cyt c的共定位減少了（圖4C）。此外，ABL 的過表達顯著抑制順鉑誘導的caspase-9活化（圖4D）。有趣的是，ABL-APAF1結構對接分析還表明，ABL中包括nt 481-540的區(qū)域，尤其是482 GAACC 486基序，與APAF1的WD2結構域中的Leu1089/Gly1178和WD1結構域中的Trp884非常接近（圖4E），它們也是通過冷凍電子顯微鏡確定的APAF1-Cyt c相互作用的特定殘基。接下來，為了進一步確定ABL是否可以阻斷Cyt c與APAF1的結合，體外轉錄的ABL有義、反義和突變有義（ΔAPAF1，APAF1 結合位點的缺失，nt 481-540）轉錄物是與純化的APAF1-WD1/WD2結構域和Cyt c蛋白一起孵育，結果表明，在存在ABL正義的情況下，與APAF1的WD1/WD2結構域結合的Cyt c的量急劇下降，但沒有ABL反義或突變正義(ΔAPAF1) (圖4F）?？傊@些數(shù)據(jù)表明ABL競爭性地抑制Cyt c與APAF1的相互作用，從而削弱caspase-9的激活。

隨后，作者檢查了ABL是否以依賴于nt 481-540核心區(qū)域的方式拮抗GC凋亡。構建了表達野生型ABL(WT)或突變型ABL(缺失nt481-540, Mut)的質粒。Annexin-V-FITC/PI染色分析結果表明，與對照表達相比，過表達ABL-WT而不是ABL-Mut可減少順鉑誘導的細胞凋亡（圖4G, H）。檢測凋亡細胞的TUNEL試驗也證實了該結果（圖4I, J）。

圖4 ABL通過競爭性阻斷APAF1與Cyt c的結合來拮抗GC細胞凋亡

為了進一步研究ABL在藥物誘導的細胞凋亡中的作用，作者還建立了GC類器官模型。當用順鉑或PTX處理類器官時，與相應的對照類器官相比，ABL上調的類器官顯示出順鉑/PTX誘導的細胞凋亡顯著減少（圖5A）。Cleaved caspase-3染色還表明，與對照組相比，ABL過表達組的凋亡細胞數(shù)量顯著減少（圖5B）。然后，作者進行了腫瘤異種移植研究，以驗證ABL在體內GC生長和順鉑敏感性中的作用。結果表明，過表達ABL可以促進腫瘤生長，過表達組與對照組相比，腫瘤的大小和重量證明了這一點（圖5C-E）。此外，ABL的過表達顯著拮抗順鉑的抗腫瘤作用（圖5C-E）。與對照組相比，ABL過表達組的ABL表達顯著增加（圖5F）。此外，免疫組織化學(IHC)結果顯示，與接受或不接受順鉑治療的對照組相比，ABL過表達組的腫瘤組織中Ki-67（一種增殖標志物）的表達增加（圖5G）。最后，cleaved caspase-3染色和TUNEL測定顯示，與順鉑處理后的對照組相比，ABL過表達組的凋亡細胞數(shù)量顯著減少（圖5G）。這些結果表明ABL通過競爭性阻斷Cyt c與APAF1的結合來拮抗藥物誘導的細胞凋亡。

圖5 ABL在體內促進GC細胞生長和多藥耐藥性

5. IGF2BP1結合并識別ABL上METTL3介導的m6A修飾，保持ABL穩(wěn)定性

為了探索ABL在GC中高表達的機制，作者首先使用UCSC基因組瀏覽器(http://genome.ucsc.edu/) 分析了ABL啟動子區(qū)域的表觀遺傳修飾。在ABL的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了高度富集的H3K27乙?；℉3K27ac）信號，表明ABL表達可能被染色質乙?；せ睢Ｒ阎狧3K27ac被P300/CBP復合物催化。然而，使用兩種特異性siRNA敲除P300并不能調節(jié)ABL的水平。因此，作者推測其他機制調節(jié)ABL的表達。

m6A甲基化已被確定為在mRNA和非編碼RNA中普遍存在的最豐富的修飾，可影響RNA的穩(wěn)定性、剪接、定位和翻譯。最近的研究報告說，IGF2BPs，包括 IGF2BP1/2/3，是一個獨特的m6A閱讀器家族，其靶向數(shù)千個RNA以增強RNA穩(wěn)定性。作者之前的研究還表明，IGF2BP3依賴性m6A修飾可維持HDGF mRNA的穩(wěn)定性。作者首先使用兩個特異性siRNA敲低IGF2BP1和IGF2BP3。只有敲低 IGF2BP1顯著抑制ABL表達，而敲低IGF2BP3 沒有明顯效果（圖6A）。此外，RNA pull-down和RIP檢測證實了ABL與IGF2BP1的相互作用（圖6B, C）。IF測定還表明，細胞質ABL與IGF2BP1共定位（圖6D）。此外，蛋白質結構域作圖分析顯示ABL特異性結合IGF2BP1的KH1/2結構域（圖6E, F）。作者還發(fā)現(xiàn)由 IGF2BP1結合/保護的ABL基序序列被鑒定為包含 nt 121-180（圖6G）。ABL中該序列（nt 121-180）的缺失完全消除了其與重組IGF2BP1的直接相互作用，而ABL中APAF1結合序列（nt 481-540）的缺失不影響這種結合（圖6H）。先前的一項研究表明，IGF2BP1/3優(yōu)先與富含CA的序列相互作用，并且IGF2BPs也可以識別關鍵的m6A基序GGAC。令人驚訝的是，作者發(fā)現(xiàn)ABL的核心序列（nt 121-180）含有“122 GGACCACA 129”基序，暗示IGF2BP1可能直接與“CACA”基序結合，進而識別m6A基序“GGAC”ABL（圖6I）。為了進一步驗證ABL的121-180 nt區(qū)域中的“GGAC”基序被m6A修飾，作者將腺苷(A)替換為胞嘧啶(C)，并插入了帶有野生型的ABL的部分121-180 nt序列或將m6A位點突變?yōu)闊晒馑孛笀蟾尜|粒（圖6J），這表明IGF2BP1在ABL-WT組中引起相對熒光素酶活性的上調，但在ABL-Mut組中沒有（圖6K）。此外，RNA-蛋白質對接分析還表明，ABL的“GGACCACA”序列在與IGF2BP1的KH1/2結構域中的幾個殘基結合中起重要作用（圖6L)。

為進一步探索m6A對ABL調控的影響，作者構建了表達野生型METTL3或其催化突變體（aa395-398，DPPW→APPA）的質粒。結果表明，在METTL3過表達細胞中ABL的表達增加，而催化突變體METTL3過表達不能促進ABL表達（圖6M）。同時，METTL3的敲低降低了ABL的水平（圖6N）。MeRIP-qPCR數(shù)據(jù)還顯示，m6A特異性抗體在廣泛型METTL3過表達后顯著富集ABL；然而，與對照細胞相比，它在催化突變METTL3過表達細胞中沒有明顯效果（圖6O）。有趣的是，作者通過RIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)IGF2BP1可以在METTL3過表達時富集更多的ABL（圖6P)，表明ABL上的m6A修飾促進了其與IGF2BP1的結合。隨后，作者探討了IGF2BP1對ABL穩(wěn)定性的影響。GC細胞用放線菌素D（一種轉錄抑制劑）處理指定的時間。ABL水平在METTL3過表達時顯示出高度穩(wěn)定，而在IGF2BP1敲低時觀察到相反的效果（圖6Q，R)。

為了進一步表征IGF2BP1-ABL軸在GC細胞存活和耐藥性中的致癌功能，進行了集落形成測定。METTL3的過表達顯著促進了GC細胞存活并抵消了順鉑誘導的細胞凋亡，但使用特異性siRNA敲低METTL3過表達的GC細胞中的ABL顯著抑制了這些作用（圖6S, T）。此外，在順鉑處理后，IGF2BP1或METTL3的敲低增加了切割的caspase-3表達和APAF1與Cyt c結合的能力（圖6U）。因此，作者的數(shù)據(jù)表明IGF2BP1結合并識別METTL3介導的ABL上的m6A修飾，并穩(wěn)定ABL轉錄物，這可能導致多藥耐藥性。

圖6 IGF2BP1結合并識別METTL3介導的m⁶A對ABL的修改，保持ABL的穩(wěn)定性

6. 脂質體介導的ABL特異性siRNA和PTX的協(xié)同遞送協(xié)同誘導體內GC細胞凋亡

為了研究ABL作為GC治療靶點的潛在價值，作者開發(fā)了載有ABL特異性siRNA的聚（乙二醇）修飾的陽離子脂質體（PEG-CLs）。陰離子ABL特異性siRNA (si-ABL) 首先由陽離子魚精蛋白縮合，形成的siRNA/魚精蛋白復合物進一步包裹在負載PTX的陽離子脂質體中（圖7A）。siRNA/魚精蛋白復合物的N:P比為4:1，總脂質量為100 nmol μg -1 (脂質/siRNA)。優(yōu)化的si-ABL和PTX共載PEG-CLs (si-ABL+PTX/PEG-CLs)，PEG與總脂質的摩爾比為 5%，平均直徑為73.12±1.92 nm，zeta電位為0.172±0.609 mV（圖7B）。

此外，作者使用異種移植小鼠模型評估了si-ABL+PTX/PEG-CLs的體內抗腫瘤功效。在指定時間通過尾靜脈將不同的脂質體制劑注射到模型小鼠中（圖7C）。結果表明，與PBS 或si-Ctrl/ PEG-CLs（圖7D-F）。在所有組中，si-ABL+PTX/PEG-CL組顯示出最高的抗腫瘤能力（圖7D-F）。此外，通過RNA-FISH分析證實，在si-ABL/PEG-CL和si-ABL+PTX/PEG-CL 組中ABL的表達顯著降低（圖7G）。作者還發(fā)現(xiàn)，在單獨使用si-ABL/PEG-CLs、PTX/PEG-CLs 或 si-Ctrl+PTX/PEG-CLs處理的小鼠中，凋亡細胞數(shù)量顯著增加，而Ki-67陽性細胞數(shù)量減少，并且這種效果在si-ABL+PTX/PEG-CL 組中比在PBS或si-Ctrl/PEG-CL 組中更明顯（圖7G)，表明si-ABL和PTX的協(xié)同抗腫瘤能力。

圖7 納米封裝的ABL特異性siRNA和PTX在體內協(xié)同誘導GC細胞凋亡

結論：

該研究結果揭示了lncRNA ABL在GC中的抗凋亡作用，這與GC細胞存活和化療藥物耐藥性相關，導致GC患者預后不良。此外，使用納米封裝的siRNA結合化療藥物靶向ABL可能代表了一種新的GC治療策略。因此，ABL可能是GC的潛在預測因子和治療靶點。

參考文獻：

Wang Q, Chen C, Xu X, Shu C, Cao C, Wang Z, et al. APAF1-Binding Long Noncoding RNA Promotes Tumor Growth and Multidrug Resistance in Gastric Cancer by Blocking Apoptosome Assembly. Adv Sci (Weinh). 2022 Oct;9(28):e2201889. doi: 10.1002/advs.202201889.