OTUD4介導(dǎo)的GSDME去泛素化增強(qiáng)鼻咽癌放療敏感性

放療抵抗是鼻咽癌（NPC）治療失敗的主要原因。以往的研究集中在細(xì)胞凋亡缺陷作為一種放療抵抗機(jī)制；然而，調(diào)節(jié)NPC放療敏感性的其他潛在死亡模式尚未被探索。活細(xì)胞顯像顯示，40-75%的放療誘導(dǎo)的鼻咽癌死亡細(xì)胞為細(xì)胞焦亡。此外，放療誘導(dǎo)的焦亡是由GSDME觸發(fā)的，GSDME被線粒體內(nèi)通路中激活的caspase-3所裂解。此外，GSDME在放療抵抗的鼻咽癌標(biāo)本中明顯下調(diào)。GSDME低表達(dá)是預(yù)后較差的預(yù)測(cè)因子，并授予鼻咽癌在體外和體內(nèi)的放療抵抗。機(jī)制上，OTUD4去泛素化并穩(wěn)定GSDME，通過(guò)促進(jìn)焦亡增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性。臨床上，鼻咽癌活檢中OTUD4與GSDME顯著相關(guān)，且OTUD4和GSDME均低表達(dá)的患者放療效果最差，生存期最差?？傊珿SDME依賴(lài)性焦亡是鼻咽癌放療敏感性的關(guān)鍵決定因素，由OTUD4通過(guò)去泛素化和穩(wěn)定GSDME調(diào)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)為研究鼻咽癌的放療抵抗提供了一個(gè)有前途的新方向，并為鼻咽癌放療敏感提供了潛在的治療靶點(diǎn)。本文于2022年11月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）放療通過(guò)自身線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞GSDME依賴(lài)性焦亡

我們觀察到放療導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征(圖1A)。細(xì)胞死亡的性質(zhì)通過(guò)乳酸脫氫酶釋放的增加被進(jìn)一步確定(圖1B)。圖1C顯示了細(xì)胞焦亡、凋亡和存活的典型過(guò)程。在6個(gè)鼻咽癌細(xì)胞系中，放療后的焦亡性細(xì)胞比例從4到24%不等(圖1D)。為了確定哪一個(gè)gasdermin家族成員負(fù)責(zé)介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞中放療誘導(dǎo)的焦亡，我們?cè)贖ONE1細(xì)胞中敲除GSDME和GSDMD的表達(dá)。抑制GSDME(圖1E)減弱典型的焦亡形態(tài)學(xué)變化，以及LDH的釋放和細(xì)胞活力的降低。同樣，放療后鼻咽癌細(xì)胞中觀察到GSDME的裂解，伴隨caspase-3和PARP的裂解以及從線粒體釋放細(xì)胞色素c(圖1F)。此外，放療后，焦亡細(xì)胞的比例、LDH的釋放、GSDME、PARP和caspase-3的裂解均呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性增加(圖1G-J)。以上數(shù)據(jù)提示，放療通過(guò)固有的線粒體凋亡途徑導(dǎo)致GSDME依賴(lài)性焦亡。

2）上調(diào)GSDME可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的焦亡和放療敏感性

活細(xì)胞成像分析顯示，在放療誘導(dǎo)的死亡細(xì)胞中，焦亡細(xì)胞占很大比例(40%)(圖2A，左)，焦亡細(xì)胞/死亡細(xì)胞比例與存活比例成反比(圖2A，右)。此外，GSDME-N的相對(duì)蛋白水平與6 Gy放療誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞株的存活率呈負(fù)相關(guān)(圖2B)。鼻咽癌細(xì)胞普遍表現(xiàn)出高于其他癌細(xì)胞的GSDME表達(dá)(圖2C)。為了進(jìn)一步評(píng)估GSDME對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放療敏感性的影響，我們構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GSDME的SUNE1和6-10B細(xì)胞(圖2D)。同時(shí)，我們使用shRNA沉默了HK1和HONE1細(xì)胞中內(nèi)源性GSDME的表達(dá)(圖2E)。SUNE1和6-10B細(xì)胞中GSDME的上調(diào)導(dǎo)致更明顯的焦亡特征(圖2D)，增加了LDH的釋放(圖2D)，增強(qiáng)了GSDME-N片段的生成(圖2F)，導(dǎo)致了較高比例的焦亡細(xì)胞(圖2G)，導(dǎo)致放療后死亡細(xì)胞比例更高(圖2J)。另一方面，HK1和HONE1細(xì)胞中GSDME的下調(diào)導(dǎo)致相反的效果(圖2E, H, I, K)。此外，過(guò)表達(dá)GSDME增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性(圖2L)，而敲除GSDME則降低了放療敏感性(圖2M)。這些數(shù)據(jù)表明，GSDME的上調(diào)通過(guò)提高GSDME-n在體外的寡聚水平，增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的焦亡和放療敏感性。

3）GSDME依賴(lài)性焦亡可使鼻咽癌在體內(nèi)對(duì)放療敏感

為了探討GSDME是否會(huì)影響鼻咽癌在體內(nèi)的放療敏感性，我們建立了小鼠移植瘤模型。每四天測(cè)量一次腫瘤直徑(圖3A)。在沒(méi)有放療的情況下，與對(duì)照組相比，GSDME上調(diào)或沉默的腫瘤在生長(zhǎng)速度(圖3B)、熒光信號(hào)(圖3C和D)、大小(圖3E)和重量(圖3F)方面沒(méi)有觀察到顯著差異。然而，與載體組相比，放療處理后過(guò)表達(dá)GSDME的腫瘤生長(zhǎng)明顯較慢(圖3B)，熒光信號(hào)較弱(圖3C和D)，體積較小(圖3E)，重量較輕(圖3F)，而HONE1細(xì)胞中GSDME敲除則相反。此外，放療后，過(guò)表達(dá)GSDME組血清LDH濃度明顯高于載體組，而GSDME敲除組血清LDH濃度較低(圖3G)。切片腫瘤的H&E染色顯示，過(guò)表達(dá)GSDME能顯著增加放療后腫瘤的炎性壞死面積，沉默GSDME則能減少炎性壞死面積(圖3H)。放療后過(guò)表達(dá)GSDME的小鼠中GSDME的裂解增加，而沉默GSDME則減少了GSDME的裂解(圖3I)。這些結(jié)果表明，GSDME通過(guò)介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞在體內(nèi)的焦亡，增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性。

4）GSDME低表達(dá)與鼻咽癌放療抵抗和預(yù)后不良相關(guān)

為了研究GSDME是否參與放療反應(yīng)，我們?cè)?0個(gè)新鮮冷凍組織和150個(gè)石蠟包埋組織中分析鼻咽癌中GSDME的水平(圖4A)。與放療敏感的鼻咽癌組織相比，放療抵抗的鼻咽癌組織始終表現(xiàn)出較低的GSDME蛋白水平(圖4B)。70.0%(105/150)患者GSDME高表達(dá)，30.0%(45/150)患者GSDME低表達(dá)(圖4C，D)。放療抵抗的組織中GSDME的IHC評(píng)分明顯低于放療敏感組織(圖4E)。隨后的分析顯示，GSDME低表達(dá)組比GSDME高表達(dá)組放療敏感性鼻咽癌病例比例低(圖4F)。在所有鼻咽癌病例中，較低的GSDME表達(dá)與較差的PFS和LRRFS顯著相關(guān)(圖4G)。此外，通過(guò)多因素Cox回歸分析，GSDME低表達(dá)被認(rèn)為是鼻咽癌5年P(guān)FS和5年LRRFS較差的獨(dú)立預(yù)后因素(圖4H)。此外，在經(jīng)鼻咽鏡證實(shí)的部分GSDME高表達(dá)的鼻咽癌放療敏感的患者中，放療治療后血清LDH水平升高(圖4I，4J)。而GSDME低表達(dá)的放療抵抗的患者的血清LDH濃度在放療后無(wú)明顯上升趨勢(shì)(圖4I，4J)。因此，GSDME表達(dá)可作為鼻咽癌患者放療敏感性的前瞻性指標(biāo)，放療后血清LDH濃度的變化可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者放療療效。

5）OTUD4去泛素化和穩(wěn)定GSDME

為進(jìn)一步探討GSDME在放療抵抗的鼻咽癌中下調(diào)的機(jī)制，采用real-time PCR方法分析GSDME在放療敏感和放療抵抗的鼻咽癌標(biāo)本中的mRNA表達(dá)。分析顯示GSDME mRNA表達(dá)在鼻咽癌放療敏感組織和放療抵抗的組織之間無(wú)明顯差異(補(bǔ)充圖)。這一發(fā)現(xiàn)表明GSDME的下調(diào)可能發(fā)生在放療抵抗的鼻咽癌的轉(zhuǎn)錄后水平。有趣的是，GSDME相互作用蛋白的MS分析集中在去泛素酶OTUD4上(圖5A和B)。在放療抵抗的鼻咽癌細(xì)胞中，OTUD4蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(圖5C)。OTUD4和GSDME之間的相互作用通過(guò)免疫共沉淀(co-IP)試驗(yàn)得到證實(shí)(圖5D)。為了確定調(diào)節(jié)OTUD4和GSDME之間相互作用的區(qū)域，我們做了OTUD4截?cái)嗪虶SDME截?cái)?圖5E)。IP分析顯示，只有截?cái)嗟腛TUD4包含與GSDME結(jié)合的OTU結(jié)構(gòu)域，這表明OTU結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕SDME是必不可少的(圖5F)。此外，GSDME的N端區(qū)域負(fù)責(zé)與OTUD4的相互作用(圖5G)。OTUD4的上調(diào)顯著增加GSDME蛋白水平，而OTUD4的敲除則減少它的表達(dá)(圖5H)。上調(diào)OTUD4顯著延長(zhǎng)了內(nèi)源性GSDME的半衰期，沉默OTUD4減少了鼻咽癌細(xì)胞中GSDME的降解半衰期(圖5I和J)。與這些結(jié)果一致的是，過(guò)表達(dá)OTUD4減弱了GSDME的泛素化(圖5K)。這些結(jié)果表明，OTUD4促進(jìn)了NPC中GSDME的去泛素化和穩(wěn)定性。

6）OTUD4通過(guò)促進(jìn)GSDME依賴(lài)性焦亡增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性

為了進(jìn)一步研究OTUD4對(duì)鼻咽癌細(xì)胞焦亡和放療敏感性的影響，我們用GSDME-shRNA轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)或未過(guò)表達(dá)OTUD4的HONE1和5-8F細(xì)胞，然后檢測(cè)它們對(duì)電離輻射的反應(yīng)(圖6A)。HONE1和5-8F細(xì)胞中OTUD4過(guò)表達(dá)導(dǎo)致更明顯的焦亡特征(圖6B)，LDH釋放增加(圖6C)，焦亡比例更高(圖6D)，放療后死亡細(xì)胞比例更高(圖6E)。此外，集落形成試驗(yàn)表明，OTUD4過(guò)表達(dá)可使HONE1和5-8F細(xì)胞對(duì)放療敏感(圖6F和G)。然而，通過(guò)GSDME敲除，OTUD4過(guò)表達(dá)的表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)。OTUD4過(guò)表達(dá)使異種移植瘤對(duì)放療敏感，沉默GSDME成功地削弱了OTUD4在體內(nèi)對(duì)放療敏感性的影響(圖6H-L)。此外，放療后OTUD4過(guò)表達(dá)組的血清LDH濃度高于對(duì)照組，但沉默GSDME恢復(fù)了上述趨勢(shì)(圖6M)。在過(guò)表達(dá)OTUD4的腫瘤移植瘤中GSDME蛋白水平更高(圖6N)。更重要的是，上調(diào)OTUD4增加了放療后鼻咽癌細(xì)胞中GSDME-N的寡聚水平。然而，通過(guò)GSDME敲低，OTUD4過(guò)表達(dá)的影響被逆轉(zhuǎn)(補(bǔ)充圖)。這些結(jié)果表明，OTUD4通過(guò)上調(diào)GSDME蛋白水平和GSDME-N的寡聚水平，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞GSDME依賴(lài)性焦亡并增強(qiáng)放療敏感性。

7）鼻咽癌中OTUD4/GSDME軸與放療反應(yīng)的臨床相關(guān)性

接下來(lái)我們研究了OTUD4下調(diào)是否具有臨床意義，以及OTUD4與GSDME是否具有臨床相關(guān)性。我們測(cè)量了150例鼻咽癌患者相同組織中OTUD4的蛋白水平。典型的GSDME低表達(dá)和高表達(dá)如圖7A所示。放療抵抗組的OTUD4 IHC評(píng)分低于放療敏感組(圖7B)。隨后的分析顯示，OTUD4低表達(dá)組的鼻咽癌放療敏感性病例比例低于OTUD4高表達(dá)組(圖7C)。在所有鼻咽癌病例中，低OTUD4表達(dá)與較差的PFS顯著相關(guān)(圖7D)。與OTUD4高表達(dá)的患者(圖7E)相比，OTUD4低表達(dá)的患者GSDME水平較低，血清LDH濃度無(wú)明顯上升趨勢(shì)，腫瘤消退較慢(圖7E)。進(jìn)一步分析顯示，OTUD4與GSDME表達(dá)呈正相關(guān)(圖7F)。更顯著的是，同時(shí)低表達(dá)OTUD4和低表達(dá)GSDME的患者放療反應(yīng)(圖7G)、PFS和LRRFS最差(圖7H)?？傊@些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了OTUD4穩(wěn)定并上調(diào)GSDME，而下調(diào)OTUD4抑制GSDME依賴(lài)性焦亡，導(dǎo)致鼻咽癌的放療抵抗和不良預(yù)后。

結(jié)論：

我們發(fā)現(xiàn)放療通過(guò)線粒體凋亡通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞GSDME依賴(lài)性焦亡。此外，OTUD4能去泛素化和穩(wěn)定GSDME，導(dǎo)致GSDME蛋白水平升高和放療誘導(dǎo)的焦亡，最終增強(qiáng)鼻咽癌的放療敏感性。以OTUD4/GSDME軸為靶點(diǎn)誘導(dǎo)焦亡是一種新的鼻咽癌放療敏感策略。

參考文獻(xiàn)：

Di M, Miao J, Pan Q, Wu Z, Chen B, Wang M, Zhao J, Huang H, Bai J, Wang Q, Tang Y, Li Y, He J, Xiang T, Weng D, Wang L, Xia J, Zhao C. OTUD4-mediated GSDME deubiquitination enhances radiosensitivity in nasopharyngeal carcinoma by inducing pyroptosis. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Nov 21;41(1):328. doi: 10.1186/s13046-022-02533-9.