三陰性乳腺癌化療和免疫治療期間固有和適應性腫瘤內免疫的單細胞轉錄組圖
乳腺癌（BC）是女性最常見的惡性腫瘤，是全球主要的健康問題。目前，BC的治療方案主要取決于組織學類型、分子標志物、臨床侵襲性和疾病分期。免疫療法與化療在三陰性乳腺癌（TNBC）中顯示出聯合臨床活性，這表明一些治療組合比其他治療組合更有效。然而，目前尚未對參與這些治療的主要免疫細胞群進行明確概述。近日，有研究使用單細胞RNA測序技術對兩種三陰性乳腺癌小鼠模型的腫瘤微環(huán)境（TME）中的免疫景觀進行了評估，發(fā)表在《Cell Death Discovery》，IF：7.109。
技術路線：
主要研究結果：
1. 兩種TNBC小鼠細胞系腫瘤微環(huán)境中的全免疫細胞景觀
經過質控，4T1的細胞總數和基因總數分別為22,403和18,124，而EMT6的細胞總數和基因總數分別為26,245和18,637。4T1和EMT6細胞TME中共識別出20組和22組具有相似基因表達的細胞（圖1）。
20個4T1細胞簇被分類為5個B細胞簇、5個Cd4 T細胞簇、3個Cd8 T細胞簇、1個NK細胞簇、1個T γδ細胞簇、2個DC細胞簇、2個巨噬細胞簇和1個中性粒細胞簇（圖1A）。另一方面，EMT6細胞系呈現22個細胞簇，分別為8個巨噬細胞簇、1個單核細胞簇、1個中性粒細胞簇、3個B細胞簇、3個DC細胞簇、4個Cd4 T細胞簇、1個Cd8 T細胞簇和1個NK細胞簇（圖1B）。
圖1 TNBC小鼠TME的免疫細胞景觀
2. 4T1細胞 TME中的Cd4 T細胞樣亞簇揭示了小鼠特異性T細胞群的促腫瘤活性
根據標簽賦值，將主要包含Cd4、調節(jié)性T細胞和γδ T細胞的細胞簇重新聚類。這一過程產生了7個簇（圖2A）：兩個祖細胞樣Cd4 T細胞簇（0和2），以Sell、Ccr7、Lef1和Tcf7基因的高表達為特征（圖2B）；Cd8樣細胞簇（簇3）顯示Cd8a基因的高表達，這些細胞可能是來源于具有混合細胞組成的細胞簇的細胞亞群，因為包含Cd4細胞群而被回收；Treg樣細胞簇（簇1）表達高水平的Foxp3和Ikzf2基因；表達Trdc基因的γδ T細胞簇（簇4）；最后，兩個具有高表達Nr4a1和Tox基因標記的耗竭樣Cd4 T細胞簇（5和6）。偽時間軌跡證實并擴展了對這一子簇組成的理解（圖2C）。三個不同的軌跡或集群分化總是從同一個根（簇2）開始。第一種將根（簇2）連接到經過第二祖細胞樣簇（簇0）的γδ T細胞簇。第二種軌跡中軌跡的末端是CD8樣簇（簇3）。而在第三種軌跡中，簇2生成經過另一種耗盡狀態(tài)的耗盡樣簇5（簇6）（圖2C）。在不同條件下，每個簇的細胞百分比差異顯著（圖2D）。γδ T細胞簇（簇4）在對照組中較高，在所有處理中均低于對照組（圖2E）。
圖2 4T1中Cd4-like T細胞亞簇分析
CD8 T細胞的亞群確定了7個簇（圖3A），這些簇也在本例中與基于一系列基因標記的不同細胞類型相關（圖3B）。Sell、Lef1、Tcf7和Ccr7基因的表達證實了兩個祖細胞樣Cd8簇（0和1）。3個簇（簇3、4和6）具有終末分化特征。簇3高表達細胞增殖相關基因Ccnb2、Cdk1、Mki67和Top2a。簇4是最活躍的簇，因為它具有高水平的Gzmb, Gzmk, Ifng和Ly6c1基因標記。簇6高表達Pdcd1、Lag3、Ctla4、Havcr2，定義為耗竭樣CD8簇。最后，簇5與Ncr1基因高水平表達的NKs相關（圖3B）。對于耗竭樣CD8 T細胞簇（簇6）在涉及環(huán)磷酰胺的治療中減少或未被發(fā)現，而在未治療的TME中它們的百分比較高。同樣，在未處理的對照中發(fā)現簇4富集，而在C140、C140 + V和C140 + αPD-1處理中，簇4的細胞百分比下降（圖3D-F）。此外，軌跡分析顯示Cd8 T細胞樣亞群的表型異質性與Cd4細胞的表型異質性相同。對于Cd4亞簇，Cd8亞簇的軌跡（圖3C）顯示了三個不同的譜系，它們共享一個作為根的簇。該細胞簇為祖細胞樣細胞簇1。第一個軌跡將根與最耗竭的Cd8簇（簇6）相連。第二個相關的簇1與NKs的簇相連；而第三條軌跡顯示了與最活躍的Cd8簇（簇4）通過簇2的聯系。這一分析證實了之前的分配和每個基因簇的基因表達特征。
圖3 4T1中Cd8-like T細胞亞簇分析
在EMT6 細胞TME中發(fā)現的大量巨噬細胞允許這些細胞亞集群。這導致了9個共享相似轉錄譜的細胞簇的鑒定（圖4A）；其中簇2、5和6由于Cx3cr1基因的表達和Ly6c1基因的陰性表達而與M2型巨噬細胞亞型相關（圖4B）。觀察每個簇在不同條件下的細胞比例，最相關的結果是M2樣簇2、5和6（圖4C-E），它們表現出相似的趨勢：它們的細胞數量在未經治療的情況下有很高的頻率，在所有涉及環(huán)磷酰胺的治療中都有所下降。另一方面，M1樣簇1僅在環(huán)磷酰胺聯合長春瑞濱（C140 + V）處理時表現出顯著增加（圖4F）。
圖4 EMT6中巨噬樣細胞亞簇分析
5. 兩種細胞系TME中共同的B細胞亞簇比例
由于在兩個TNBC細胞系TME中被歸類為B細胞的細胞數量相當，作者探究了這些細胞群的亞集群的異同（圖5）。4T1細胞系的TME顯示出5個集群，而EMT6的TME中觀察到8個集群。EMT6模型具有更結構化的子集群，揭示了更多的亞種群。其中，EMT6簇4類似于干擾素誘導的幼稚B細胞（表達Ifit3），而簇1和簇2作為4T1中屬于簇1的細胞的一部分，通過Pim1的表達可以清楚地歸類為介于增殖和幼稚樣B細胞之間的中間狀態(tài)（圖5C, D）。同樣，簇4和簇7分別在4T1和EMT6中表達Cd38基因，但Mki67基因不表達（圖5C, D）。此外，在兩個細胞系中，經處理和未處理的tme之間，共享相同轉錄譜的細胞比例大致相當。事實上，在未處理的樣本中，germinal B細胞（4T1和EMT6中簇4和7）數量很少，而在C140 + αPD-1處理中，兩種小鼠模型的germinal B細胞均增加（圖5F-H）。此外，proliferative B細胞群的比例也有相似之處 （圖5E, G）。對于4T1的簇2和EMT6中簇3，順鉑+ αPD-1條件下germinal B細胞的百分比最高，表明兩種腫瘤對這一特定治療組合的反應具有共同的行為（圖5C）。
圖5 4T1和EMT6中B-like細胞的亞聚類分析
結論：
作者對免疫TME的精細表征可作為新研究的資源，旨在改善TNBC患者的治療選擇。