一個新的長鏈非編碼RNA SP100-AS1通過海綿化miR-622和穩(wěn)定ATG3誘導(dǎo)結(jié)直腸癌放射抵抗
雖然放療是治療結(jié)直腸癌(CRC)的重要手段，但臨床上放療抵抗的發(fā)生率仍然很高。長鏈非編碼RNA (lncRNA)通過在轉(zhuǎn)錄或翻譯后水平調(diào)控基因或蛋白在結(jié)直腸癌放療抵抗中發(fā)揮重要作用。該研究旨在鑒定與放射抗拒相關(guān)的新型lncRNA。該研究發(fā)表于《Cell Death & Differentiation》，IF:12.067。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. SP100-AS1表達(dá)上調(diào)與結(jié)直腸癌放療抵抗相關(guān)
采用RNA-seq分析比較8例放療敏感和8例放療抵抗患者結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)(圖1A)。結(jié)果表明，與輻射敏感樣本相比，267個lncRNA在輻射抗拒樣本中表達(dá)上調(diào)(圖1B)，其中SP100-AS1顯著過表達(dá)。接下來，RT-qPCR分析表明，SP100-AS1在CRC組織(n = 44)中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(圖1C)。綜上所述，上述結(jié)果表明SP100-AS1可能在CRC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。此外，研究者假設(shè)SP100-AS1可能通過其在放射抗拒組織中的異常表達(dá)調(diào)控CRC的放射敏感性。因此，研究者收集了具有放射敏感和放射抗拒臨床特征的結(jié)直腸癌患者的組織。如圖1D所示，放射抗拒的結(jié)直腸癌組織中SP100-AS1的表達(dá)量較高。綜上所述，研究者的研究結(jié)果表明，SP100-AS1參與CRC的進(jìn)展和放射抵抗。采用RT-qPCR檢測正常人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460和結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS177T、HCT116、CT26、HCT8、HT29、LoVo和SW480中內(nèi)源性SP100-AS1的表達(dá)(圖1E)。結(jié)果表明，與正常上皮細(xì)胞株相比，CRC細(xì)胞中SP100-AS1的表達(dá)水平較高，尤其是在HCT116和SW480細(xì)胞株中，并用于后續(xù)實(shí)驗。有趣的是，SP100-AS1的高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的不良生存相關(guān)(圖1F)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明lncRNA SP100-AS1的過表達(dá)與CRC的放射抵抗和低生存率相關(guān)。
圖1 SP100-AS1在CRC中表達(dá)上調(diào)，且與放療呈正相關(guān)
2. 敲低SP100-AS1可增強(qiáng)結(jié)直腸癌的放射敏感性
在建立了SP100-AS1在CRC患者組織和細(xì)胞系中的異常表達(dá)模式后，研究者研究了這種lncRNA如何調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和生存。如前所述，SP100-AS1在HCT116和SW480細(xì)胞中以劑量依賴性方式表達(dá)最多(圖1E)。克隆形成實(shí)驗檢測SP100-AS1對HCT116和SW480細(xì)胞放射敏感性的影響。值得注意的是，當(dāng)SP100-AS1表達(dá)下調(diào)時，這兩種細(xì)胞的放射敏感性顯著增加(圖2A, C)。此外，研究者對HCT116和SW480細(xì)胞在4 Gy劑量下的活力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)沉默SP100-AS1降低了細(xì)胞的增殖和活力(圖2B, D)。
放射治療引起的DNA雙鏈斷裂是公認(rèn)的，必須在腫瘤進(jìn)一步生長之前進(jìn)行修復(fù)。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)需要開發(fā)一種新的方法來阻止DNA修復(fù)和阻止腫瘤生長，或至少減緩它們以延長患者的生存期。阻斷DNA損傷修復(fù)是治療CRC的一種特別有吸引力的策略，因為CRC對輻射具有高度抵抗力。正如預(yù)期的那樣，抑制SP100-AS1可以誘導(dǎo)γ-H2AX的表達(dá)，γ-H2AX是DNA損傷的顯著標(biāo)志物(圖2E)。接下來，作者分析SP100-AS1對細(xì)胞凋亡的影響。Annexin V/PI雙染色顯示，與對照組相比，SP100-AS1缺失顯著增加了HCT116細(xì)胞的凋亡反應(yīng)(圖2F)。這表明SP100-AS1參與了CRC輻射誘導(dǎo)的DNA損傷和細(xì)胞凋亡。因此，敲低SP100-AS1可以增加CRC的放射敏感性。
圖2 SP100-AS1下調(diào)加重了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
3. SP100-AS1在體內(nèi)具有顯著的放射抗拒性
通過建立BALB/c裸鼠移植瘤模型，研究SP100-AS1在體內(nèi)的作用。如圖3A所示，通過慢病毒感染HCT116細(xì)胞，SP100-AS1被穩(wěn)定敲低，接種的異種移植瘤比對照組的腫瘤生長減慢。此外，IR后，與對照組相比，SP100 - AS1敲低的HCT116腫瘤細(xì)胞生長緩慢(圖3A)。分割I(lǐng)R后，沉默SP100-AS1可進(jìn)一步減緩CRC腫瘤的生長(圖3B)。實(shí)驗結(jié)束后，測量腫瘤重量(圖3C)。隨后，轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)實(shí)驗表明，敲低SP100-AS1在2 Gy輻射下引起更多的DNA損傷，并降低Ki67染色，表明SP100-AS1下調(diào)抑制CRC的生長速度，尤其是在暴露于輻射時(圖3D)。綜上所述，這些結(jié)果表明，SP100-AS1沉默可以在體內(nèi)外增強(qiáng)CRC的放射敏感性。
圖3 SP100-AS1下調(diào)降低了受照結(jié)直腸癌細(xì)胞的體內(nèi)生長
4. SP100-AS1通過自噬途徑增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射抵抗活性
自噬通路的激活在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的放射抵抗中發(fā)揮重要作用。為了探究自噬通路是否參與HCT116和SW480細(xì)胞的輻射抗性，作者定量分析了敲低SP100-AS1后，自噬流標(biāo)記物L(fēng)C3-II和p62/SQSTM1的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示LC3-II降低，p62蛋白水平升高(圖4A)。此外，作者使用LC3-GFP-RFP報告系統(tǒng)來評估自噬體形成。LC3是一種與綠色和紅色熒光蛋白融合的膜結(jié)合蛋白。與RFP不同，GFP在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定。相應(yīng)計算RFP點(diǎn)位或RFP/GFP比值來測量自噬通量。敲低SP100-AS1后，用過表達(dá)LC3-GFP-RFP的慢病毒感染HCT116細(xì)胞，并給予相應(yīng)水平的輻射處理。與之前的研究結(jié)果一致，與對照組相比，放射治療對自噬的誘導(dǎo)作用要弱得多，自噬流顯著減少(圖4B)。此外，western blot和IHC分析表明，在IR處理的CRC異種移植瘤中，p62蛋白表達(dá)顯著降低，LC3-II蛋白水平顯著升高，而沉默SP100-AS1可以逆轉(zhuǎn)這一情況。因此，這些結(jié)果得出結(jié)論，輻射可以誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞的自噬，沉默SP100-AS1可以緩解這一效應(yīng)。
圖4 SP100-AS1通過自噬途徑調(diào)控HCT116細(xì)胞增殖
5. SP100-AS1通過ATG5和Beclin1調(diào)控自噬通路
ATG5和Beclin1是宏觀自噬通路的重要上游調(diào)控因子，過表達(dá)ATG5和Beclin1可直接激活自噬信號通路。因此，作者研究了SP100 - AS1調(diào)控的自噬是否可以通過過表達(dá)ATG5和Beclin1來拯救。在HCT116和SW480細(xì)胞中敲低SP100-AS1后，ATG5和Beclin1表達(dá)上調(diào)，并檢測LC3-II的蛋白表達(dá)。如圖5A所示，SP100-AS1下調(diào)導(dǎo)致的自噬流減少被ATG5或Beclin1上調(diào)所恢復(fù)。此外，Annexin V/PI雙染后采用流式細(xì)胞術(shù)定量凋亡，表明上調(diào)ATG5和Beclin1可減少敲低SP100-AS1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖5B)。如前所述，使用LC3-GFP-RFP慢病毒報告檢測自噬流密度，并測量每個細(xì)胞的紅色點(diǎn)狀點(diǎn)數(shù)量。在HCT116細(xì)胞中，上調(diào)ATG5或Beclin1可以顯著增加SP100-AS1敲低后的點(diǎn)狀細(xì)胞數(shù)量(圖5C)。此外，作者研究了ATG5和Beclin1對HCT116和SW480細(xì)胞增殖和存活的功能和作用。這些結(jié)果表明，在這兩個細(xì)胞系中，ATG5或Beclin1上調(diào)均可挽救SP100-AS1下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞增殖下降(圖5D)，這意味著SP100-AS1通過經(jīng)典的宏觀自噬途徑調(diào)節(jié)自噬。
圖5 ATG5和Beclin1過表達(dá)挽救了SP100-AS1對自噬的調(diào)節(jié)作用
6. SP100-AS1與ATG3相互作用并調(diào)節(jié)其蛋白穩(wěn)定性
lncRNA可以與特定的蛋白質(zhì)相互作用來發(fā)揮其功能。通過熒光原位雜交(FISH)檢測SP100-AS1在HCT116和SW480細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，探討SP100-AS1是否能通過這一機(jī)制發(fā)揮作用。令人驚訝的是，SP100-AS1在細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光，這表明該lncRNA可以與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合并進(jìn)行相關(guān)功能，包括細(xì)胞增殖和輻射抗性(圖6A, B, C)。接下來，作者進(jìn)行了RNA下拉實(shí)驗，以發(fā)現(xiàn)與SP100-AS1相互作用的蛋白。如圖6D所示，銀染法在分子量35 kDa處檢測到多條條帶(圖6D)。質(zhì)譜分析顯示ATG3肽水平顯著升高。進(jìn)一步對SP100-AS1進(jìn)行RIP實(shí)驗，western blot結(jié)果顯示SP100-AS1能與ATG3特異性結(jié)合(圖6E)。另一方面，使用抗atg3抗體鑒定相關(guān)的結(jié)合RNA，結(jié)果顯示，與對照IgG組相比，SP100-AS1在atg3結(jié)合的提取液中顯著富集(圖6F)。嚴(yán)格地說，對SP100-AS1下拉試驗中提取的蛋白進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)，ATG3蛋白與SP100-AS1的義序列特異性結(jié)合，但與反義對照無特異性結(jié)合(圖6G)。綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)ATG3是SP100-AS1在體內(nèi)和體外的特異性結(jié)合蛋白。
在確定了SP100-AS1可以與ATG3相互作用之后，作者接下來試圖研究SP100-AS1是否可以調(diào)節(jié)ATG3蛋白的穩(wěn)定性或功能。首先，作者在HCT116細(xì)胞中檢測敲低SP100-AS1后ATG3的蛋白水平。下調(diào)和過表達(dá)SP100-AS1分別可顯著降低和升高ATG3蛋白水平(圖6H)。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性受多種途徑和機(jī)制調(diào)控，尤其是泛素化依賴的蛋白酶體降解信號通路。與此一致的是，ATG3可以泛素化。因此，作者評估了SP100-AS1是否可以通過蛋白酶體途徑影響ATG3蛋白的穩(wěn)定性。在HCT116細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Flag-tagged ATG3后，HA標(biāo)記的泛素蛋白過表達(dá)，而內(nèi)源性SP100-AS1 lncRNA被敲低。抗flag抗體免疫沉淀后，用抗HA抗體檢測ATG3泛素化水平。作者發(fā)現(xiàn)，沉默SP100-AS1增加了ATG3的泛素化水平，表明SP100-AS1介導(dǎo)的ATG3降解參與了泛素化依賴性降解(圖6I)。此外，作者還研究了ATG3在放線菌酮(cycloheximide, CHX)(一種成熟的蛋白質(zhì)合成抑制劑)處理下的降解過程。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)敲低SP100-AS1可以加速ATG3的降解(圖6J)。在HCT116細(xì)胞中敲低或過表達(dá)SP100-AS1，然后用蛋白酶體抑制劑MG132處理。如圖6K所示，敲低SP100-AS1引起的ATG3蛋白降解被挽救。此外，過表達(dá)SP100-AS1和MG132處理后，ATG3的表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果證實(shí)了SP100-AS1與ATG3相互作用并調(diào)節(jié)其蛋白穩(wěn)定性。
圖6 SP100-AS1與ATG3相互作用并調(diào)節(jié)其蛋白穩(wěn)定性。
7. SP100-AS1在結(jié)直腸癌中可作為miR-622的海綿
為了進(jìn)一步研究SP100-AS1調(diào)控ATG3蛋白表達(dá)的機(jī)制，作者評估了SP100-AS1是否可以作為ATG3 mRNA的miRNA海綿。通過RIP實(shí)驗確定AGO2是否與SP100-AS1相關(guān)，AGO2在miRNA通路中發(fā)揮多種作用，并通過產(chǎn)生pre-miRNA參與miRNA組裝過程。有趣的是，在HCT116和SW480細(xì)胞系中均檢測到AGO2和SP100-AS1之間存在顯著的相互作用(圖7A, B)。接下來，作者試圖確定哪些miRNA可以直接與SP100-AS1結(jié)合。作者使用lncRNA探針篩選幾個miRNA與SP100-AS1之間的相互作用。采用靶向SP100-AS1的特異性探針，通過pull-down實(shí)驗純化與SP100-AS1相關(guān)的miRNA。結(jié)果顯示，SP100-AS1和miR-622的富集最為顯著(圖7C)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了miR-622和SP100-AS1在HCT116細(xì)胞中的相互作用。如圖7D所示，SP100-AS1可以與miR-622顯著結(jié)合。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SP100-AS1在CRC中扮演了miR-622海綿的角色。
生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SP100-AS1的3'UTR區(qū)含有miR-622的靶向基序。構(gòu)建熒光素酶實(shí)驗系統(tǒng)檢測miR-622對SP100-AS1 mRNA的調(diào)控作用(圖7D)。螢火蟲熒光素酶盒連接到野生型或突變的SP100-AS1 3'UTR區(qū)域。作者發(fā)現(xiàn)，突變的SP100-AS1 3'UTR不能與miR-622相互作用(圖7E)。熒光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞。過表達(dá)miR-622時，攜帶野生型區(qū)域的熒光素酶強(qiáng)度低于突變型(圖7F)。相反，抑制miR-622 (miR-622-in)誘導(dǎo)熒光素酶活性顯著增加，這一活性也被結(jié)合位點(diǎn)突變所抑制(圖7G)。綜上所述，作者證實(shí)了miR-622可以直接結(jié)合SP100-AS1并影響其在CRC細(xì)胞中的mRNA穩(wěn)定性。
圖7 SP100-AS1在結(jié)直腸癌中充當(dāng)miR-622的海綿
8. miR-622靶向ATG3 mRNA調(diào)控自噬流
考慮到SP100-AS1海綿化miR-622并下調(diào)自噬流，作者試圖研究miR-622是否影響自噬通路。在HCT116細(xì)胞中過表達(dá)miR-622或SP100-AS1。有趣的是，在SP100-AS1過表達(dá)的HCT116細(xì)胞中，異位表達(dá)miR-622可以恢復(fù)p62和LC3-11的表達(dá)(圖8A, B)。因此，作者假設(shè)SP100-AS1可以作為miR-622的海綿，阻止其對ATG3 mRNA的影響，從而穩(wěn)定ATG3，促進(jìn)自噬流。采用計算機(jī)模擬方法分析ATG3的3'UTR區(qū)域以驗證這一假設(shè)。出人意料的是，作者檢測到了miR-622的一個靶向基序。接下來，作者進(jìn)行了熒光素酶測定，將螢火蟲熒光素酶盒插入野生型和突變的ATG3 3'UTR區(qū)域的前面(圖8C)。如圖8D所示，過表達(dá)miR-622可以降低野生型熒光素酶的表達(dá)，而共轉(zhuǎn)染SP100-AS1可以挽救熒光素酶的活性。相反，共轉(zhuǎn)染攜帶突變ATG3 3'UTR區(qū)域的質(zhì)粒不能恢復(fù)熒光素酶的活性(圖8D)。然后研究HCT116細(xì)胞中ATG3的內(nèi)源性表達(dá)，結(jié)果顯示miR-622在mRNA和蛋白水平顯著降低ATG3的表達(dá)，而與SP100-AS1共表達(dá)可以恢復(fù)ATG3的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，使用siRNA敲低SP100-AS1也可以降低ATG3 mRNA水平(圖8E、F、G)。
圖8 SP100-AS1通過與miR-622相互作用調(diào)控ATG3表達(dá)
結(jié)論：
該研究表明SP100-AS1/miR-622/ATG3軸有助于CRC患者的放射抵抗和自噬活性，提示其作為改善CRC放射治療反應(yīng)的治療靶點(diǎn)具有巨大的前景。
參考文獻(xiàn)：
Zhou Y, Shao Y, Hu W, Zhang J, Shi Y, Kong X, Jiang J. A novel long noncoding RNA SP100-AS1 induces radioresistance of colorectal cancer via sponging miR-622 and stabilizing ATG3. Cell Death Differ. 2022 Aug 17. doi: 10.1038/s41418-022-01049-1. Epub ahead of print. PMID: 35978049.