樹突狀細(xì)胞功能微調(diào)

樹突狀細(xì)胞（DC）微調(diào)炎癥和耐受性反應(yīng)以保護(hù)免疫病理。然而，共同調(diào)節(jié)因子在維持這種平衡方面的作用尚未得到探討。本研究發(fā)現(xiàn)NCoR1及其同源物NCoR2（SMRT）可通過調(diào)節(jié)STAT3信號通路維持DC炎癥和耐受性反應(yīng)平衡。本研究于2022年9月發(fā)表在《Frontiers in Immunology》IF：8.786期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、SMRT KD cDC1 DCs增強(qiáng)激活/共刺激

構(gòu)建穩(wěn)定的Ncor2基因敲除（SMRT KD）和空載體對照的cDC1細(xì)胞系。敲除效率在mRNA水平和蛋白水平上得到驗(yàn)證（圖1A）。然后，用RT-qPCR檢測對照組和SMRT KD cDC1細(xì)胞在CpG激活前后2小時和6小時促炎因子（Il12b）和抗炎因子（Il10）mRNA的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)，與對照細(xì)胞相比，在SMRT KD cDC1中，CpG刺激后Il12b顯著增加，Il10表達(dá)同時減少（圖1A）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與對照組相比，SMRT KD cDC1中的陽性細(xì)胞比例和共刺激分子(CD80、CD86和CD40)顯著增加（圖1B）。接下來，通過MHC-II和MHC-I在SMRT KD cDC1中的表達(dá)來研究抗原呈遞能力。在CpG和pIC激活過程中，MHC-I陽性細(xì)胞比例顯著增加，而MHC-II水平保持不變（圖1）。MHC-II和MHC-I分子的MFI變化也表現(xiàn)出類似的趨勢。在CpG刺激18h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD80、CD86和MHC-II的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SMRT KD BMcDC1較對照顯著升高，而MHC-I則呈升高趨勢（圖1C）。

圖1 TLR9與CpG-B配對后SMRT缺失的cDC1和BMcDC1的激活和成熟增強(qiáng)

2、SMRT KD cDC1增加促炎因子IL6，IL-12，IL-23而減少IL-10

接下來，檢測了cDC1系和原發(fā)系BMcDC1中重要的DC反應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與對照cDC1比較，CpG和pIC處理6h后，SMRT敲除顯著增強(qiáng)了陽性細(xì)胞的比例和和MFI轉(zhuǎn)變即IL6，IL-12p40，IL-23p19（圖2A）。在未受刺激和CpG激活6h的SMRT KD cDC1中IL-23p19均顯著升高。相反，與對照組相比，CpG和pIC激活的SMRT KD cDC1上IL-10顯著降低（圖2A）。為了進(jìn)一步估計這些細(xì)胞因子在CpG激活的cDC1系培養(yǎng)液中的水平，進(jìn)行了生物復(fù)合物檢測，發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-12p40和IL-12p70的分泌水平在SMRT KD cDC1中明顯增加，同時IL-10也隨之減少（圖2B）。與DC中的趨勢相似，與對照組相比，在SMRT KD BMcDC1中觀察到陽性細(xì)胞百分比顯著增加，IL-6和IL-23的MFI呈增加趨勢，而IL-10的表達(dá)減少。然而，在SMRT KD BMcDC1中IL-12p40的陽性細(xì)胞及其MFI雖然高于對照組，但并不顯著（圖2C）。這些結(jié)果表明SMRT KD cDC1具有很強(qiáng)的炎癥表型。

圖2激活的SMRT KD cDC1顯示炎性細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)

3、OT-II CD4 + Th細(xì)胞與SMRT KD cDC1共培養(yǎng)增強(qiáng)Th1和Th17分化

為了解SMRT缺失cDC1對CD4 + Th細(xì)胞增殖和分化的功能影響，從OT-II轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟分離純化的CD4 + T細(xì)胞與SMRT KD和對照cDC1細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。分離OT-II T細(xì)胞，與OVA脈沖和CpG或pIC激活的DC共培養(yǎng)72h檢查增殖，96h檢查分化。在增殖實(shí)驗(yàn)中，我們用efluor-670增殖染料標(biāo)記OT-II T細(xì)胞。

與對照相比，SMRT KD細(xì)胞增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖（圖3A,B）。眾所周知，IL-6抑制FOXP3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而抑制Treg的分化，并與IL-23一起通過誘導(dǎo)RORgt的表達(dá)導(dǎo)致Th17細(xì)胞的發(fā)育。另一方面，已知IL-12p70上調(diào)T-bet導(dǎo)致Th1分化。在OT-II共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在CpG激活的SMRT KD cDC1組，CD44+ T-bet + IFN-g +和CD44 + RORgt+ IL-17+細(xì)胞的比例增加，其表明Th1和Th17亞型頻率增強(qiáng)的比例顯著高于對照組DC（圖3C-F）。為進(jìn)一步證實(shí)Th17極化增加，檢測了共培養(yǎng)細(xì)胞的上清中IL-17細(xì)胞因子的分泌水平，發(fā)現(xiàn)其水平顯著升高（圖3G）。所有的下游分析都在這些雙陽性細(xì)胞中進(jìn)行。

圖3 SMRT KD cDC1增強(qiáng)了Th1和Th17細(xì)胞的體外極化

4、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的PBMCs的Ncor2表達(dá)降低

RA等自身免疫性疾病被廣泛歸類為Th1和Th17疾病，IL-10的表達(dá)在這些患者中也被發(fā)現(xiàn)大幅降低。早前已經(jīng)證實(shí)Th1反應(yīng)與自身免疫性疾病有關(guān)。然而，對IFN-g和IL-12-/-小鼠的研究表明，這些小鼠有很高的概率發(fā)展為膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。本研究中，已經(jīng)確定了Th17細(xì)胞在自身免疫中的作用。因此，為確定Ncor2的表達(dá)是否在自身免疫性疾病中發(fā)生改變，對11例RA患者和14例健康供體的PBMCs進(jìn)行了Ncor2的RT- qPCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對照比較，RA患者PBMCs中Ncor2表達(dá)顯著降低（圖3H）。這一結(jié)果提示，在RA疾病中Ncor2的降低可能與炎癥表型的增加有關(guān)。

5、SMRT KD cDC1與OT-I CD8⁺ T細(xì)胞共培養(yǎng)增加T細(xì)胞的細(xì)胞毒性

由于觀察到在SMRT耗盡的cDC1中MHC-I表達(dá)顯著增加，于是進(jìn)一步確定這些DC是否有可能增加CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，從OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟中分離出CD8+ T細(xì)胞，并將其與對照組和SMRT KD cDC1共培養(yǎng)。首先用SIINFKL (OVA肽257-264)脈沖DC過夜。脈沖DC被CpG或pIC激活2h后與純化的CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)。然后檢測共培養(yǎng)CD8+ T細(xì)胞在72h后的增殖和96h后IFN-g、perforin和顆粒酶B（GrB）的表達(dá)。使用eFluor 670標(biāo)記的CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行增殖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的OT-I CD8+ T細(xì)胞增殖未見明顯變化（圖4A,B）。與對照組相比，CpG激活的SMRT KD cDC1共培養(yǎng)的表達(dá)IFN-g、perforin和GrB的CD8+ CD44+ T細(xì)胞陽性率顯著上調(diào)（圖4C）。

圖4 SMRT KD cDC1增加了CD8 T淋巴細(xì)胞體外perforin，granzyme和IFN-g的產(chǎn)生

6、過繼轉(zhuǎn)移CpG脈沖SMRT缺失的cDC1后，OVA誘導(dǎo)的遲發(fā)性超敏（OVA- DTH）小鼠足墊炎癥增強(qiáng)，并且降低小鼠B16F10黑色素瘤負(fù)擔(dān)

建立OVA- DTH小鼠模型，以研究對照和SMRT KD cDC1 DCs的免疫調(diào)節(jié)。首先在小鼠耳后皮下用佐劑（明礬alum）乳化的OVA致敏；對照組和SMRT KD cDC1經(jīng)OVA脈沖4h后經(jīng)CpG活化2h后于第14天過繼轉(zhuǎn)移；第20天，DC過繼轉(zhuǎn)移一周后，小鼠左腳墊局部再次經(jīng)OVA致敏刺激，以誘導(dǎo)超敏介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；在OVA再次刺激后每12h至72h測量足墊腫脹，以檢查免疫反應(yīng)的嚴(yán)重程度（圖5A）。結(jié)果顯示，與對照組cDC1和PBS處理的動物相比，CpG激活的SMRT KD cDC1處理的小鼠腳墊炎癥明顯增加（圖5B）。接下來，檢查腘窩淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)中的T細(xì)胞亞型。與PBS處理組相比，注射SMRT KD DC的小鼠顯示出明顯增加的Th1亞型，表現(xiàn)為IFN-g和T-bet陽性T細(xì)胞數(shù)量（圖5C）。同時，注射SMRT KD cDC1的小鼠中Th17 T細(xì)胞數(shù)量也顯著增加表現(xiàn)為IL-17和RORgt陽性細(xì)胞（圖5D）。這些結(jié)果表明，DC中SMRT敲低會在宿主體內(nèi)產(chǎn)生非常強(qiáng)烈的炎癥T細(xì)胞反應(yīng)。

對SMRT KD cDC1增強(qiáng)細(xì)胞毒活性的觀察引導(dǎo)進(jìn)一步研究這些細(xì)胞的抗腫瘤潛能。已廣泛報道DC疫苗治療誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)抗原（TAA）特異性的溶瘤CD8+ T細(xì)胞活性。因此，為評估SMRT KD cDC1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性CD8 + T細(xì)胞增強(qiáng)的生理影響，在C57BL/6小鼠中建立了B16F10黑色素瘤模型。假設(shè)，與對照組相比，接種了載有B16抗原的炎性SMRT KD cDC1疫苗的動物能夠抵抗不斷增加的腫瘤負(fù)擔(dān)。首先，在動物左側(cè)皮下接種SMRT KD和對照細(xì)胞，這些細(xì)胞之前被B16F10細(xì)胞裂解液脈沖處理，以誘導(dǎo)對B16F10腫瘤的免疫。3天后，注射強(qiáng)化劑量。強(qiáng)化劑量7天后，在小鼠右側(cè)皮下注射106 B16F10細(xì)胞（圖5E）。從腫瘤發(fā)生后的第7天到第16天，每隔一天測量一次腫瘤體積。與對照組DC和PBS處理組相比，SMRT cDC1組的腫瘤負(fù)荷明顯減少（圖5F,G）。為進(jìn)一步評估CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，在腫瘤發(fā)生后的第16天殺死小鼠，解剖腫瘤并通過膠原酶處理制成單細(xì)胞懸液。用PMA/Ionomycin/BFA刺激這些細(xì)胞5小時，用流式細(xì)胞儀分析CD8+ T-細(xì)胞。與對照組或PBS組相比，SMRT KD cDC1接種動物的效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為perforin、GzB和IFN-g陽性群體的比率增加（圖5H）。此外，SMRT KD cDC1接種動物腫瘤的重量顯著減輕（圖5I）。

圖5過繼轉(zhuǎn)移Control和SMRT KD DC的C57BL/6小鼠的DTH反應(yīng)和腫瘤消退

7、cDC1中NCoR1和SMRT的比較基因組和轉(zhuǎn)錄組分析顯示，STAT3信號介導(dǎo)的IL- 10調(diào)控存在差異

作者此前發(fā)現(xiàn)NCoR1直接結(jié)合并強(qiáng)烈抑制DC的耐受性基因，如Il10、Il27、Cd83和Socs3。NCoR1敲除急劇增加了這些基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致耐受性基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致了Treg的產(chǎn)生。與此相反，本研究發(fā)現(xiàn)，NCoR1同源物SMRT KD MutuDC在體外和體內(nèi)顯著增加炎癥反應(yīng)。因此，作者進(jìn)行了NCoR1和SMRT的基因組比較，以及NCoR1和SMRT KD DCs的轉(zhuǎn)錄組分析，以了解NCoR1和SMRT的不同基因調(diào)節(jié)。

在CpG刺激6小時下，與對照組比較，SMRT KD cDC1的差異基因表達(dá)分析顯示，分別有1273和934個基因上調(diào)和下調(diào)（圖6A）。通過SMRT的ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)，與下調(diào)的基因相比，大量的SMRT結(jié)合基因被確定為上調(diào)，這支持了其作為輔抑制因子的作用（圖6B）。此外，在SMRT KD條件下，直接上調(diào)靶基因的IPA分析顯示炎癥反應(yīng)途徑的上調(diào)，如IL-12信號通路（圖6C）。然而，與NCoR1相反，SMRT KD顯示IL-10信號通路在CpG刺激6h時下調(diào)（圖6D）。

為識別NCoR1和SMRT KD后表現(xiàn)出不同表達(dá)模式的基因集，對DEGs進(jìn)行無監(jiān)督K-means聚類，并確定了6個聚類（圖6E）。cluster-1中的基因在NCoR1和SMRT KD中均表現(xiàn)出成倍增加的變化，并參與豐富的通路，如“Interferon signaling”，“Activation of IRF by cytosolic pattern recognition receptors”，“IL-12 signaling and production in macrophages”。相反，cluster-2基因在SMRT和NCoR1 KD 6h CpG條件下表現(xiàn)出差異調(diào)控，富集的通路為“Th2 pathway”，“STAT3 pathway”，“IL-17-A signaling”和“IL-10 Signaling”（圖6F）。這些觀察結(jié)果清楚地表明，炎癥免疫反應(yīng)基因如Il12b和Il6均被NCoR1和SMRT抑制，而調(diào)控基因如Il10、Socs3僅被NCoR1強(qiáng)烈抑制（圖6G）。

此外，NCoR1和SMRT峰的差異結(jié)合鑒定出NCoR1主導(dǎo)(12,473)、普通NCoR1-SMRT主導(dǎo)(5949)和SMRT主導(dǎo)(2707)基因組區(qū)域（圖6H, I）。與NCoR1顯性區(qū)和常見的NCoR1-SMRT結(jié)合區(qū)主要分布在內(nèi)含子或遠(yuǎn)端基因間區(qū)相比，SMRT主導(dǎo)區(qū)在啟動子-近端區(qū)域占優(yōu)勢，（圖6H）。這進(jìn)一步表明，SMRT主要通過啟動子-近端結(jié)合調(diào)控基因，而NCoR1和常見的NCoR1-SMRT結(jié)合基因則通過遠(yuǎn)端調(diào)控元件調(diào)控。

此外，與基因組區(qū)域相關(guān)的基因KEGG通路分析顯示，NCoR1或常見NCoR1-SMRT結(jié)合的CpG依賴性增加主要富集“Th1 and Th2 pathway”，“Th-17 signaling pathway”，“NFkB signaling pathway”，“JAK-STAT signaling pathway”（圖6J）。CpG激活后，NCoR1和SMRT在TSS的幾個近端或遠(yuǎn)端區(qū)域共同占據(jù)炎癥(Il12b)和耐受基因(Il10)，表明這兩種抑制因子都參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)基因（圖6K）。

為確定在這些輔抑制子結(jié)合的基因組區(qū)域在CpG激活6小時前后募集的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)行de novo基序富集分析，發(fā)現(xiàn)PU.1、RUNX2和Jun-Fos/AP1轉(zhuǎn)錄因子基序在幾乎所有NCoR1都富集，而SMRT結(jié)合的基因組區(qū)域在未受刺激或CpG激活6小時時富集。有趣的是，NFkB基序在CpG顯性NCoR1、顯性SMRT和普通NCoR1-SMRT結(jié)合位點(diǎn)被富集。在未受刺激和6h CpG激活條件下，IRF8和IRF4基序分別在顯性NCoR1和常見NCoR1- SMRT區(qū)域富集（圖6L）。

除上述基序外，還發(fā)現(xiàn)在CpG顯性NCoR1-SMRT和CpG顯性SMRT基因組區(qū)STAT3基序富集。由于NFkB家族成員和Stat3轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)炎癥(Il12b, Il6)和耐受(Il10, Socs3)基因表達(dá)中起著重要作用，為進(jìn)一步了解耐受基因的下調(diào)，檢測了與Jak-Stat信號通路相關(guān)的其他基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)其他幾種Jak-Stat信號的調(diào)控存在明顯差異，SMRT KD DC中Jak-Stat信號被下調(diào)而NCoR1 KD DC中無變化（圖7A, B）?？偟膩碚f，基因組和轉(zhuǎn)錄組比較分析表明，與NCoR1 KD DC相比，SMRT KD DC顯示STAT3-IL-10軸失調(diào)。

圖6整合基因組學(xué)分析（RNA-seq和ChIP-seq）鑒定SMRT和NCoR1在cDC1免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的差異作用

8、SMRT介導(dǎo)的NR4A1下調(diào)抑制mTOR-STAT3信號，導(dǎo)致IL-10抑制

STAT3 TF在Jak-Stat信號通路和調(diào)控Il10和Socs3的表達(dá)中起著核心作用。在SMRT KD cDC1中，NFkB抑制基因Nfkbia和Tnfaip3在CpG刺激6h后也被下調(diào)。首先，為確認(rèn)NCoR1和SMRT中p-STAT3的差異調(diào)控，在CpG激活后0h、2h和6h對NCoR1 KD、SMRT KD和對照cDC1中的p-STAT3進(jìn)行WB。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，SMRT KD cDC1中p-STAT3表達(dá)下調(diào)，而在NCoR1 KD DC中p-STAT3表達(dá)上調(diào)（圖7C, D）。

據(jù)報道，STAT3結(jié)合Il10基因調(diào)控其表達(dá)。所以作者對p-STAT3進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)，然后進(jìn)行RT-qPCR，以推斷對照組、NCoR1 KD和SMRT KD cDC1在CpG處理2h后p-STAT3與Il10基因的結(jié)合情況。觀察到，相對于對照DC，SMRT KD DC中p-STAT3與Il10的結(jié)合減少，而另一方面，與對照DC相比，NCoR1 KD細(xì)胞中p-STAT3與Il10的結(jié)合增強(qiáng)（圖7E）。

此外，為了解這些DC中STAT3信號的上游控制，作者查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)mTOR可控制STAT3激活，另一方面mTOR受核受體NR4A1（又叫Nur77）調(diào)控。首先檢測NCoR1和SMRT敲低cDC1中p-mTOR的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在NCoR1 KD cDC1中p-mTOR上調(diào)，而在SMRT敲低后p-mTOR急劇降低（圖7F,G）。此外，在SMRT和NCoR1缺失DC中Nr4a1 (Nur77)的差異調(diào)控。SMRT KD導(dǎo)致Nr4a1表達(dá)下調(diào)，而NCoR1 KD對Nr4a1表達(dá)無顯著影響（圖7H）。使用IGV檢測了ChIP-seq數(shù)據(jù)中NCoR1和SMRT在Nr4a1上的直接結(jié)合，觀察到在CpG激活6h后，SMRT而不是NCoR1結(jié)合TSS轉(zhuǎn)錄本（圖7H）。作者還通過評估在CpG激活2h和6h前后SMRT KD和對照cDC1中的NR4A1蛋白表達(dá)來證實(shí)這一結(jié)果：與對照細(xì)胞相比，SMRT KD DC中的NR4A1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（圖7I, J）。

為進(jìn)一步證實(shí)NR4A1確實(shí)在SMRT KD細(xì)胞中通過mTOR控制STAT3信號，使用NR4A1慢病毒構(gòu)建了穩(wěn)定的NR4A1 KD和空載體cDC1細(xì)胞，以確認(rèn)其在mTOR- STAT3 - IL-10信號中的作用。在NR4A1敲除效率通過WB證實(shí)（圖7K, L）。在CpG激活2h后檢測p-mTOR和p-STAT3，發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比，NR4A1缺失的cDC1中p-mTOR和p-STAT3顯著減少（圖7K, L）。此外，在NR4A1缺失的cDC1中，CpG處理6h后IL-10陽性細(xì)胞顯著減少，相應(yīng)的MFI也減少（圖7M）。此外，作者還嘗試在SMRT KD cDC1中短暫過表達(dá)NR4A1 ORF，但由于過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞狀態(tài)不佳，未能成功進(jìn)行這一分析，因此，使用了另一種方法。報道稱6- MP可誘導(dǎo)細(xì)胞NR4A1的表達(dá)。因此，使用6-MP增強(qiáng)SMRT KD cDC1中Nr4a1的表達(dá)，看看它是否可以補(bǔ)充IL-10的表達(dá)。結(jié)果顯示6-MP處理增強(qiáng)SMRT KD cDC1中Nr4a1的表達(dá)，導(dǎo)致IL-10的表達(dá)增加（圖7N）。這些結(jié)果證實(shí)，SMRT KD介導(dǎo)的NR4A1下調(diào)導(dǎo)致STAT3激活減少，從而降低IL-10水平，增強(qiáng)cDC1的炎癥表型。

圖7 Nurr-77、mTOR、Stat3信號調(diào)節(jié)IL-10在SMRT - KD cDCs中的表達(dá)

參考文獻(xiàn)：

Jha A, Ahad A, Mishra GP, Sen K, Smita S, Minz AP, Biswas VK, Tripathy A, Senapati SB, Gupta B, Acha-Orbea H and Raghav SK (2022) SMRT and NCoR1 fine-tune inflammatory versus tolerogenic balance in dendritic cells by differentially regulating STAT3 signaling. Front. Immunol. 13:910705. doi: 10.3389/fimmu.2022.910705