LSD1缺失降低胃癌外泌體PD-L1，恢復(fù)T細(xì)胞應(yīng)答

組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1 (LSD1)在胃癌(GC)中的表達(dá)明顯升高，可能與胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。據(jù)報(bào)道，LSD1在黑色素瘤和乳腺癌中通過(guò)程序性細(xì)胞死亡1配體1 (PD-L1)抑制腫瘤免疫。LSD1在胃癌免疫微環(huán)境中的作用尚不清楚。本研究中采用免疫組化(IHC)和免疫印跡(Western Blot)分析胃癌患者LSD1和PD-L1的表達(dá)情況。通過(guò)體內(nèi)探索，LSD1 KO(敲除)的小鼠前胃癌(MFC)細(xì)胞在615只小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)明顯慢于T細(xì)胞缺失的BALB/c裸鼠。同時(shí)在GC標(biāo)本中，LSD1的表達(dá)與CD8的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，LSD1通過(guò)誘導(dǎo)外泌體中PD-L1的積累，抑制T細(xì)胞在GC微環(huán)境中的反應(yīng)，而在GC細(xì)胞中，膜PD-L1保持不變。使用外泌體作為載體，LSD1也阻礙了其他癌細(xì)胞的T細(xì)胞反應(yīng)，而LSD1的缺失挽救了T細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在依賴供體細(xì)胞中LSD1存在的情況下，可調(diào)節(jié)MFC細(xì)胞增殖，其作用與體內(nèi)外泌體PD-L1介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫有關(guān)。上述結(jié)果表明，LSD1缺失降低胃癌外泌體PD-L1，恢復(fù)T細(xì)胞應(yīng)答；這一發(fā)現(xiàn)提示了LSD1可能調(diào)控胃癌腫瘤免疫的新機(jī)制，為胃癌的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)。本文于2022年3月發(fā)表于Molecular Cancer (IF=41.444)上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

(1) LSD1的去除通過(guò)抑制GC中T細(xì)胞的反應(yīng)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)

為了確定LSD1在GC中對(duì)腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用，使用TIMER2.0平臺(tái)分析了LSD1和免疫細(xì)胞信號(hào)之間的相關(guān)性。在各種免疫細(xì)胞中，LSD1與腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，主要發(fā)生在GC中(圖1a)。癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌中LSD1的mRNA與CD8和CD3的mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖1b)。因此，LSD1被認(rèn)為是通過(guò)抑制T細(xì)胞反應(yīng)來(lái)維持腫瘤的生長(zhǎng)。在人GC細(xì)胞系BGC-823和MGC803以及MFC細(xì)胞系中建立LSD1 KO細(xì)胞系(補(bǔ)充圖未展示)。分別將MFC和MFC LSD1 KO細(xì)胞皮下接種于615只小鼠和T細(xì)胞缺陷BALB/c裸鼠。在BALB/c裸鼠中，MFC LSD1 KO組的腫瘤重量和體積與MFC組相當(dāng)，而在615只小鼠中，MFC LSD KO組的腫瘤幾乎完全根除(圖1c,d)，而它們的體重保持一致(補(bǔ)充圖未展示)。這些結(jié)果表明，LSD1可能通過(guò)抑制T細(xì)胞反應(yīng)來(lái)維持腫瘤的生長(zhǎng)。此外，將人GC細(xì)胞與抗CD3/CD28珠激活的T細(xì)胞共孵育，無(wú)論LSD1是否被敲除，BGC-823和MGC-803細(xì)胞在體外都能穩(wěn)定生長(zhǎng)(圖1e)，而當(dāng)LSD1缺失時(shí)，這兩種癌細(xì)胞更容易被激活的T細(xì)胞殺死(圖1f)。通過(guò)分析圖1c中615只小鼠的剝脫腫瘤，LSD1的缺失導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)增加(圖1g)。綜上所述，LSD1是GC中T細(xì)胞應(yīng)答的抑制因子，LSD1的缺失可能通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞在體內(nèi)外殺傷能力而顯著抑制GC細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖1：LSD1 KO可通過(guò)促進(jìn)胃癌中T細(xì)胞的應(yīng)答抑制腫瘤生長(zhǎng)

(2) GC標(biāo)本中LSD1與CD8呈負(fù)相關(guān)，與PD-L1呈正相關(guān)

為了探討LSD1如何影響腫瘤浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞水平，我們?cè)谟梦覀儍?nèi)部GC標(biāo)本構(gòu)建的組織微陣列(TMA)阻滯劑上進(jìn)行免疫組化，分析LSD1、CD8和T細(xì)胞吸引趨化因子、C-X-C基序趨化因子9 (CXCL9)和C-X-C基序趨化因子10 (CXCL10)的表達(dá)。圖2a,b表明，LSD1在GC組織中過(guò)表達(dá)，與CD8呈負(fù)相關(guān)(圖2c)，而CXCL9和CXCL10在GC組織中幾乎不表達(dá)(補(bǔ)充圖未展示)。由于抑制LSD1刺激抗腫瘤免疫，增強(qiáng)PD-1/PD-L1阻滯劑在乳腺癌和黑色素瘤中的抗腫瘤療效，而PD-L1是免疫治療的有效靶點(diǎn)，可通過(guò)結(jié)合PD-1抑制T細(xì)胞激活，我們推測(cè)LSD1可能主要通過(guò)抑制PD-L1激活和增殖T細(xì)胞而參與胃癌的發(fā)展。為探討胃癌中LSD1與T細(xì)胞輔抑制因子PD-L1的相關(guān)性，收集36例胃癌標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步分析。圖2d表明，腫瘤組織中LSD1和PD-L1的表達(dá)高于癌旁組織，且PD-L1與LSD1呈正相關(guān)(圖2e)。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，PD-L1的表達(dá)也與GC中LSD1 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(圖2f)。這些結(jié)果初步支持了我們的假設(shè)，LSD1和PD-L1之間可能存在調(diào)節(jié)關(guān)系。

圖2：胃癌標(biāo)本中LSD1表達(dá)與免疫調(diào)節(jié)基因呈正相關(guān)

(3) 抑制LSD1可下調(diào)GC中PD-L1的水平

為了進(jìn)一步探討LSD1對(duì)GC中PD-L1的調(diào)控作用，我們對(duì)GC細(xì)胞中總PD-L1和膜PD-L1進(jìn)行了量化。如圖3a,b所示，不同GC細(xì)胞系中總PD-L1和膜PD-L1表達(dá)明顯不均。為了研究LSD1對(duì)PD-L1的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)使用LSD1抑制劑GSK2879552(圖3c,d)或使用sgRNA基因抑制LSD1(圖3e,f)。當(dāng)LSD1被廢去后，PD-L1的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平上均被下調(diào)。膜PD-L1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(補(bǔ)充圖未展示)。已有研究報(bào)道PD-L1可通過(guò)蛋白酶體和溶酶體途徑降解，但LSD1抑制劑是否影響PD-L1的降解途徑尚不清楚。采用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)和溶酶體抑制劑氯喹(CQ)處理GC細(xì)胞。LSD1的缺失并沒有減少蛋白酶體和溶酶體對(duì)PD-L1的降解(補(bǔ)充圖未展示)。為了探究LSD1在內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，我們檢測(cè)了恢復(fù)內(nèi)體標(biāo)志蛋白R(shí)AB11和多泡小體標(biāo)志蛋白TSG101。LSD1缺失可增加RAB11的表達(dá)，PD-L1與RAB11和TSG101在細(xì)胞質(zhì)中共定位(補(bǔ)充圖未展示)。SEM結(jié)果還顯示，敲除LSD1后，多泡體數(shù)量減少(圖3g,h)，刪除LSD1后，TSG101表達(dá)減少(圖3i)。以上結(jié)果表明，LSD1的缺失可以降低PD-L1的總表達(dá)量，維持細(xì)胞膜PD-L1水平，減少細(xì)胞外通過(guò)多泡體分泌PD-L1，促進(jìn)PD-L1在GC細(xì)胞中向膜循環(huán)。

圖3：抑制LSD1可下調(diào)GC中PD-L1基因水平

(4) LSD1缺失下調(diào)GC中外泌體PD-L1

已有研究報(bào)道外泌體PD-L1也可發(fā)揮免疫抑制功能。PD-L1通過(guò)外泌體作為載體分泌，可能受LSD1調(diào)控。從GC細(xì)胞中分離出的外泌體，進(jìn)行掃描電鏡和NTA分析。GC細(xì)胞衍生的外泌體的大小在30到200 nm之間(圖4a,b)。使用蔗糖梯度離心純化的外泌體進(jìn)行的進(jìn)一步分析表明，外泌體標(biāo)記CD63、ALG-2相互作用蛋白X (ALIX)和CD9在20-40%的蔗糖餾分中移動(dòng)，PD-L1與這些外泌體標(biāo)記共定位(圖4c)。PD-L1被打包到GC細(xì)胞的外泌體中，PD-L1積累在來(lái)自幾個(gè)人GC細(xì)胞系的外泌體中(圖4d)。為了進(jìn)一步證實(shí)外泌體中的PD-L1來(lái)自癌細(xì)胞而非其他成分，采用外泌體分泌抑制劑GW4869抑制胞外囊泡的分泌，當(dāng)從相同數(shù)量的細(xì)胞中純化外泌體時(shí)，外泌體分泌明顯減少，當(dāng)BGC-823細(xì)胞暴露于GW4869時(shí)，觀察到膜PD-L1和總PD-L1(補(bǔ)充圖未展示)的顯著積累。在被抑制的BGC-823和MGC-803細(xì)胞中，當(dāng)LSD1在基因上(圖4e)和藥理學(xué)上(圖4f)被刪除時(shí)，外泌體PD-L1被降低，表明LSD1在正向調(diào)節(jié)外泌體PD-L1的積累方面具有潛在作用。使用基于磁珠的方法從LSD1缺失的BGC-823和MGC-803細(xì)胞中收集的外泌體也比野生型細(xì)胞的外泌體含有更少的PD-L1(圖4g,h)。當(dāng)LSD1缺失時(shí)，GC細(xì)胞來(lái)源的外泌體濃度降低(圖4i)。因此，我們認(rèn)為L(zhǎng)SD1 KO可以維持細(xì)胞膜PD-L1的同時(shí)減少外泌體的分泌，抑制外泌體分泌有可能挽救這種作用。用GW4869處理BGC-823細(xì)胞，對(duì)膜PD-L1進(jìn)行定量。去除LSD1可以減少PD-L1總量(圖3d,f)，但保持膜PD-L1(補(bǔ)充圖未展示)。使用GW4869抑制外泌體分泌可以誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞中膜PD-L1的積累，GW4869還可以在LSD1缺失的BGC-823細(xì)胞中重新誘導(dǎo)膜PD-L1的積累(圖4j)。綜上所述，PD-L1存在于GC細(xì)胞衍生的外泌體中，LSD1的去除減少了細(xì)胞總PD-L1的量，但保持了膜PD-L1，并減少了外泌體PD-L1的分泌和積累。

圖4：LSD1缺失下調(diào)GC中外泌體PDL1

(5) LSD1的缺失逆轉(zhuǎn)了GC衍生的外泌體PD-L1的直接T細(xì)胞應(yīng)答抑制

為保證外泌體PD-L1功能的保留，采用PD-1/PD-L1結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)外泌體PD-L1與PD-1的結(jié)合能力。標(biāo)記有PKH26的GC細(xì)胞外泌體與重組PD-1涂層的孔結(jié)合，當(dāng)BGC-823細(xì)胞中LSD1被刪除時(shí)，這種結(jié)合可以顯著取消(圖5a)。用GC細(xì)胞源性外泌體孵育的T細(xì)胞的SEM圖像也驗(yàn)證了GC細(xì)胞源性外泌體可以直接與T細(xì)胞結(jié)合，而LSD1 KO消除了這種相互作用(圖5b)。為了確定LSD1是否可以通過(guò)TCR途徑調(diào)節(jié)外泌體PD-L1介導(dǎo)的免疫抑制作用，采用抗CD3/CD28珠激活健康人體供體PBMCs，并與B-EXO共孵育，用于T細(xì)胞刺激模型，并測(cè)定T細(xì)胞的激活和增殖。以CD8+ T細(xì)胞的激活標(biāo)記CD69為代表，抗CD3/CD28珠大大提高了CD69的表達(dá)，B-EXO處理后CD8+ T細(xì)胞中CD69表達(dá)明顯下調(diào)，而B KO-EXO或用PD-L1抗體或PD-1重組體阻斷外泌體PD-L1的作用挽救了CD8+ T細(xì)胞中被抑制的CD69表達(dá)(圖5c)。T細(xì)胞增殖在B-EXO存在時(shí)下降，而在LSD1缺失時(shí)沒有，說(shuō)明GC細(xì)胞源性外泌體的免疫抑制功能被LSD1 KO去除(圖5d)，這與外泌體中PD-L1的表達(dá)水平一致。為了進(jìn)一步證實(shí)外泌體可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的GC細(xì)胞殺傷能力，將激活的PBMCs與GC細(xì)胞共培養(yǎng)，并在存在或不存在LSD1的情況下，用BGC-823細(xì)胞來(lái)源的外泌體處理。外泌體可以減少T細(xì)胞殺傷以保持GC細(xì)胞存活，而B KO-EXO由于PD-L1的表達(dá)極少，對(duì)T細(xì)胞殺傷沒有影響(圖5e,f)。T細(xì)胞激活過(guò)程中分泌的三種主要反應(yīng)性細(xì)胞因子IL-2(圖5g)、IFN-γ(圖5h)和TNFα(圖5i)的分泌也可以被B-EXO抑制，并被B KO-EXO挽救。這些結(jié)果一致表明，GC細(xì)胞衍生的外泌體可以直接抑制TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞激活，依賴于LSD1調(diào)節(jié)的外泌體PD-L1。

圖5：LSD1的缺失逆轉(zhuǎn)了GC衍生的外泌體PD-L1的直接T細(xì)胞應(yīng)答抑制

(6) LSD1的缺失通過(guò)影響靶細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了GC細(xì)胞來(lái)源的外泌體在T細(xì)胞應(yīng)答中的抑制作用

為了探索GC來(lái)源的外泌體向其他癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，我們用熒光PD-L1抗體對(duì)B-EXO和B KO-EXO進(jìn)行染色，并與GC細(xì)胞系MGC-803孵育。外泌體PD-L1被轉(zhuǎn)運(yùn)到目標(biāo)GC細(xì)胞中(圖6a)。B-EXO可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞中膜PD-L1的積累，而B-KO-EXO處理的BGC-823細(xì)胞中沒有顯著的PD-L1積累(圖6b)；在總PD-L1上也看到了類似的作用(圖6c,d)。當(dāng)B-EXO處理后，PD-1與細(xì)胞表面的結(jié)合顯著增加，而PD-1在B KO-EXO處理的細(xì)胞上的結(jié)合則保持不變(圖6e,f)。活化的T細(xì)胞與B-EXO處理的BGC823細(xì)胞共孵育時(shí)，CD3+CD8+ T細(xì)胞中CD69的表達(dá)降低，而B KO-EXO處理的細(xì)胞組中CD69的表達(dá)沒有降低(圖6g)。輔助T細(xì)胞殺傷分析的表型分析也表明，B-EXO處理的GC細(xì)胞有逃避T細(xì)胞殺傷的意圖，而B KO-EXO對(duì)癌細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞殺傷的敏感性沒有顯著影響(圖6h)。這些結(jié)果表明，外泌體中的PD-L1可以運(yùn)輸?shù)狡渌┘?xì)胞中，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞從T細(xì)胞的免疫逃逸，而LSD1的缺失降低了GC細(xì)胞來(lái)源的外泌體的免疫抑制功能，這說(shuō)明LSD1是一種潛在的腫瘤免疫治療的免疫抑制因子。

圖6：LSD1的缺失通過(guò)影響靶細(xì)胞中PDL1的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了GC細(xì)胞來(lái)源的外泌體在T細(xì)胞應(yīng)答中的抑制作用

(7) LSD1缺失GC細(xì)胞的外泌體在體內(nèi)通過(guò)外泌體PD-L1促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫

鑒于GC細(xì)胞衍生的外泌體在體外抑制T細(xì)胞的激活，我們進(jìn)行了一個(gè)驗(yàn)證性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。LSD1抑制劑GSK2879552可下調(diào)MFC細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，LSD1缺失可降低外泌體PD-L1的表達(dá)，LSD1抑制劑GSK2879552和ORY1001也一樣(補(bǔ)充圖未展示)。我們使用了615只攜帶MFC細(xì)胞的小鼠建立胃癌模型，以探索胃癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體是否可以調(diào)節(jié)體內(nèi)腫瘤的進(jìn)展。LSD1 KO顯著抑制了615只小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤的老鼠注射液從MFC細(xì)胞明顯大于那些未經(jīng)治療的腫瘤(MFC組)，而注射MFC LSD1 KO細(xì)胞外泌體的小鼠(MFC+KO EXO組)腫瘤比這兩組小得多(圖7a-c)。當(dāng)MFC和MFC LSD1的外泌體與PD-1孵育以阻塞PD-L1外泌體(MFC+CON EXO+PD-1組和MFC+KO EXO+PD-1組)時(shí)，MFC+CON EXO+PD-1組、MFC+KO EXO+PD-1組和MFC+KO EXO組之間的腫瘤體積和腫瘤重量無(wú)顯著差異(圖7a-c)。我們推測(cè)外泌體治療在一定程度上抑制了腫瘤中CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)。與MFC組相比，MFC+CON EXO組CD8+ T細(xì)胞比例明顯增加，而LSD1 KO細(xì)胞衍生的外泌體促進(jìn)了CD8+ T細(xì)胞的比例(圖7d)。當(dāng)PD-1重組蛋白阻斷外泌體PD-L1時(shí)，MFC+CON EXO+PD-1組CD8+ T細(xì)胞比例高于MFC+CON EXO組(圖7d)。MFC+KO EXO組與MFC+KO EXO+PD-1組間CD8+ T細(xì)胞比例無(wú)明顯差異(圖7d)。腫瘤浸潤(rùn)性CD3和CD8在這些腫瘤中的表達(dá)(圖7e,f)以及細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的數(shù)量(圖7g,h)的結(jié)果一致。攜帶MFC LSD1 KO細(xì)胞的小鼠血漿中外泌體PD-L1的表達(dá)量遠(yuǎn)低于攜帶MFC細(xì)胞的小鼠血漿中表達(dá)量(圖7i)，提示LSD1具有通過(guò)外泌體PD-L1調(diào)節(jié)全身免疫反應(yīng)的潛力?？傊?，LSD1的缺失可以抑制同質(zhì)GC模型中MFC細(xì)胞的增殖。同時(shí)，外泌體依靠供體細(xì)胞中LSD1的存在，可調(diào)節(jié)MFC細(xì)胞增殖，其作用依賴于體內(nèi)外泌體PD-L1介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫。

圖7：來(lái)自LSD1被廢的GC細(xì)胞的外泌體在體內(nèi)通過(guò)外泌體PD-L1促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫

結(jié)論：

綜上所述，LSD1的缺失通過(guò)減少外泌體中PD-L1的積累來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞活性，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，而在GC細(xì)胞中，膜PD-L1保持不變。不僅如此，LSD1以外泌體為載體，通過(guò)外泌體PD-L1阻礙了其他癌細(xì)胞的T細(xì)胞反應(yīng)，而LSD1的缺失則恢復(fù)了T細(xì)胞的功能。這些結(jié)果揭示了LSD1通過(guò)外泌體PD-L1調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫的新途徑，為以LSD1為靶點(diǎn)的GC免疫治療提供了新的策略。

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