Gpx4/GSH抗氧化軸挽救Mtb感染中細(xì)胞壞死和宿主耐藥
結(jié)核分枝桿菌（Mtb）引起的結(jié)核病仍然是全球十大死亡原因之一，并且在當(dāng)前COVID-19以前是單一感染原的主要原因。GSH過氧化物酶4（Gpx4）是一種在預(yù)防鐵依賴性脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。本研究說明Gpx4調(diào)控的壞死在Mtb感染中的有害作用，并確定Gpx4/GSH抗氧化軸作為宿主定向治療結(jié)核病干預(yù)的候選靶點(diǎn)。文章于2022年11月發(fā)表在期刊《Journal of Experimental Medicine》上，IF：11.45。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1、肺結(jié)核患者GPX4/GSH及脂質(zhì)過氧化水平與肺部疾病的關(guān)系
作為評估GPX4在調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和結(jié)核病中潛在作用的第一步，作者首先分析巴西和南非不同隊列的結(jié)核病患者該途徑中的元素。作者采用酶基測定法觀察巴西隊列，發(fā)現(xiàn)與HC相比，肺結(jié)核（PTB）患者血漿中GSH水平降低（圖1A），脂質(zhì)過氧化水平升高（圖1B）。進(jìn)一步分析，PTB患者體內(nèi)的GSH和脂質(zhì)過氧化物（MDA）水平呈現(xiàn)一個負(fù)相關(guān)，但HC樣本中沒有（圖1C）。
接下來根據(jù)疾病嚴(yán)重程度和肺受損狀況對巴西PTB患者進(jìn)行分層。該分析顯示在重度與非重度或單側(cè)與雙側(cè)肺病理學(xué)上GSH和脂質(zhì)過氧化水平表現(xiàn)出明顯的差異（圖1D-E），GSH水平下降與脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)與更嚴(yán)重的疾病密切相關(guān)。此外，主成分分析證實該患者隊列中疾病嚴(yán)重度、脂質(zhì)過氧化和GSH水平三者之間的相關(guān)性（圖1F-G）。這些發(fā)現(xiàn)支持人類感染Mtb疾病與GSH調(diào)節(jié)的脂質(zhì)過氧化作用相關(guān)聯(lián)，該過程由GPX4進(jìn)行生化調(diào)節(jié)。
此外，qRT-PCR顯示患有嚴(yán)重疾病的巴西隊列的GPX4 mRNA水平顯著降低（圖1H）。為評估GPX4在PTB疾病中的位置，作者檢測巴西PTB病人時候的肺組織，用該酶特異性多克隆抗體孵育后，在肉芽腫邊緣的細(xì)胞中觀察到強(qiáng)烈的GPX4染色，其共定位區(qū)域為CD68陽性。相反，在壞死核周圍的區(qū)域觀察到GPX4染色極少（圖1I）。因此，與HC相比，PTB患者GSH/GPX4反應(yīng)與脂質(zhì)過氧化異常。
圖1 PTB患者GSH/GPX4反應(yīng)與脂質(zhì)過氧化異常
2、Gpx4在感染Mtb的NHPs和高壞死B6.Sst1s老鼠肺組織中的表達(dá)定位
為進(jìn)一步拓展對TB病人的認(rèn)識，作者同樣評估感染H37Rv-mCherry Mtb毒株16周后恒河猴肺組織切片GPX4蛋白的表達(dá)。從這些動物分離的細(xì)胞肉芽腫顯示，與位于肉芽腫周圍的細(xì)胞相比，Gpx4在肉芽腫中心的染色減少（圖2A）。值得注意的是，根據(jù)感染動物的肺組織切片中GPX4的形態(tài)和位置，在類似肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)胞中檢測到GPX4的強(qiáng)烈染色（圖2A，左）。此外，從這些恒河猴中獲得的壞死肉芽腫在肉芽腫內(nèi)的活細(xì)胞中也表現(xiàn)出更強(qiáng)的GPX4染色（圖2A，右）。
為評估Gpx4在小鼠模型中的壞死病理學(xué)表達(dá)，作者用被氣溶膠感染H37Rv Mtb強(qiáng)毒株35 d后的B6.Sst1S小鼠，進(jìn)行肺組織學(xué)檢查。雖然該動物品系的整體肺組織病理學(xué)不同于NHPs（非人靈長類動物）和人類，但再次觀察到肉芽腫病變中心部位的Gpx4染色減少，而位于邊緣的細(xì)胞和肉芽腫周圍的肺組織區(qū)域的酶染色增強(qiáng)（圖2B，左、中）。有趣的是，在肉芽腫內(nèi)發(fā)生壞死的細(xì)胞中觀察到Gpx4染色減少（圖2B，右）?？傊?，這些觀察揭示實驗感染動物肺肉芽腫組織中GPX4空間細(xì)胞表達(dá)的差異，這將與該酶在調(diào)節(jié)發(fā)病機(jī)制中的作用相一致。
圖2：Gpx4在感染Mtb恒河猴和B6. Sst1s老鼠的肉芽腫肺組織中表達(dá)空間分布
3、過表達(dá)該酶的小鼠肺部病理降低時，Gpx4全基因缺失的感染Mtb小鼠表現(xiàn)出組織壞死增加
為評估Gpx4在Mtb誘導(dǎo)的疾病中的功能作用，作者檢測在整體動物或特定細(xì)胞區(qū)室酶缺陷或轉(zhuǎn)基因過表達(dá)Gpx4的小鼠中分枝桿菌感染的結(jié)果。
首先研究cre-ERT2posGpx4f1/f1小鼠，tamoxifen治療后，Gpx4在整個動物（大腦除外）的表達(dá)出現(xiàn)整體下降（圖3A）。當(dāng)被氣溶膠感染時，與類似感染的非缺陷floxed小鼠（Gpx4f1/f1）相比，這些小鼠的肺部和脾脹均顯示明顯增加的細(xì)菌負(fù)荷（圖3B-C）。此外，與對照動物的相似染色切片相比，Gpx4缺陷小鼠肺細(xì)胞外環(huán)境中AFB的數(shù)量大幅增加（圖3D）。定量分析切片顯示，在Gpx4缺陷的肺中，實質(zhì)區(qū)大小和Mtb感染的肉芽腫組織顯著增大（圖3E-F）。重要的是，與對照組相比，Gpx4缺陷小鼠肺中每個細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量顯著增加（圖3G）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，所有Gpx4缺陷動物的肺單細(xì)胞懸液中，通過LAA染色測定的CD11b+細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化水平增加（圖3H）。
下面用Gpx4轉(zhuǎn)基因的小鼠檢測Gpx4過表達(dá)的影響。與WT非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾?，這些動物雙肺和脾脹的細(xì)菌負(fù)荷均有所減少（圖3I-J）。SytoxGreen染色測定肺壞死減少（圖3K-L）。對Gpx4轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織均漿的多重蛋白分析顯示，與WT相比，許多與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子的水平顯著降低（圖3M）。有趣的是，與WT動物相比，感染的轉(zhuǎn)基因小鼠還顯示出更多的肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）（圖3N）。這提示Gpx4在Mtb感染過程中調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的命運(yùn)中起作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測，感染Mtb的Gpx4轉(zhuǎn)基因小鼠的肺中AM和間質(zhì)巨噬細(xì)胞（IMs）的脂質(zhì)過氧化染色也出現(xiàn)下降（圖3O）。
圖3 Gpx4基因整體表達(dá)的改變調(diào)節(jié)宿主對Mtb感染的耐藥性
4、髓系間室中Gpx4缺失導(dǎo)致Mtb感染小鼠的宿主抵抗力降低和組織壞死增加
Gpx4在肺內(nèi)的多個細(xì)胞系中表達(dá)（圖4A），可能通過調(diào)節(jié)對病原體的氧化應(yīng)激反應(yīng)來潛在地影響宿主對Mtb的抗性。為評估髓系細(xì)胞Gpx4相對于其他產(chǎn)生酶的細(xì)胞群的特異性貢獻(xiàn)，作者在一系列條件敲除小鼠中檢測Mtb感染的結(jié)果，這些小鼠具有基因工程的Cre-loxP元件，以靶向Gpx4在含譜系的髓系細(xì)胞中的表達(dá)。
當(dāng)通過氣溶膠感染H37Rv菌株，CD45creGpx4fl / fl小鼠表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的Mtb易感性，幾乎比非Gpx4缺陷的floxed對照動物早4個月死亡（圖4B）。這種抵抗力的喪失與肺和脾臟中細(xì)菌負(fù)荷的顯著升高以及45 d p.i時明顯的肺壞死有關(guān)（圖4C-E），這讓人聯(lián)想到上面在感染的cre-ERT2+Gpx4fl/fl小鼠中觀察到的情況。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，與感染非缺陷型Gpx4f1/f1動物相比，Mtb感染CD45 creGpx4fl/fl小鼠的肺勻漿顯示促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平升高，最顯著的變化發(fā)生在IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平以及KC/CXCL1和MCP-1/CCL2（圖4F）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，Mtb感染CD45 creGpx4fl/fl小鼠肺中AM的頻率和數(shù)量顯著減少（圖4G-H），同時IM增加（圖4G-I）。有趣的是，這些動物在肺髓樣腔室中也表現(xiàn)出Ly6G表達(dá)細(xì)胞的優(yōu)先富集（圖4J）。雖然認(rèn)為這些CD45creGpx4fl/fl動物中Gpx4缺乏的影響并非髓系細(xì)胞所特有，但通過LAA染色測量和流式細(xì)胞術(shù)分析，研究的每個個體髓系細(xì)胞群均顯示脂質(zhì)過氧化增加（圖4K）。
作者接下來檢查LysMcreGpx4fl/fl小鼠的Mtb感染，該小鼠在骨髓隔室中特異性地顯示出Gpx4表達(dá)缺陷。盡管其表型不如在CD45 creGpx4fl/fl小鼠中觀察到的嚴(yán)重，但LysMcreGpx4fl/fl小鼠也表現(xiàn)出對Mtb感染的易感性增加，如120 p.i.時死亡率增加以及肺和脾細(xì)菌負(fù)荷增加（圖5A-B）。此外，對這些動物的肺組織病理學(xué)檢查顯示單個核細(xì)胞中抗酸細(xì)胞數(shù)量增加（圖5C）。流式細(xì)胞術(shù)對單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行分析，Mtb-infected LysMcreGpx4fl / fl老鼠中對活的IM總數(shù)量無變化（圖5D, F），120 p.i.時表現(xiàn)出AM的深度消耗（圖5D-E）。此外，在這些動物的IM中檢測到脂質(zhì)過氧化物水平升高，同時IM標(biāo)記染色的死亡細(xì)胞數(shù)量增加（圖5G-H）。中性粒細(xì)胞在Mtb-infected LysMcreGpx4fl / fl老鼠的肺實質(zhì)中富集，同時也表現(xiàn)出脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)和在肺實質(zhì)中積累為死細(xì)胞（圖5I-K）。然而，在Mtb-infected LysMcreGpx4fl/fl小鼠的肺部觀察到的炎癥表型似乎不是Gpx4對中性粒細(xì)胞的作用引起的，因為Gpx4缺陷是專門針對Mtb-infected Mrp8 creGpx4fl/fl小鼠細(xì)胞的，在生存和細(xì)菌負(fù)荷方面，均未檢測到的宿主對病原體的抗性損失（圖5L-M）。
總之，這些發(fā)現(xiàn)表明Gpx4在巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞，而不是中性粒細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)在表達(dá)，對于研究Mtb感染中的宿主抗性的實驗是重要的。
圖4造血腔內(nèi)Gpx4表達(dá)的缺失增強(qiáng)宿主對Mtb感染的易感性
圖5 Gpx4表達(dá)對體內(nèi)巨噬細(xì)胞抵抗Mtb感染具有重要作用
5、髓系靶向缺失Gpx4表達(dá)的Mtb感染小鼠BMDMs表現(xiàn)出增強(qiáng)的鐵死亡
Gpx4是細(xì)胞鐵死亡的調(diào)控中心，之前的體內(nèi)體外實驗都發(fā)現(xiàn)Mtb感染引發(fā)的細(xì)胞壞死。為正式測試Gpx4在Mtb誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用，作者研究來自骨髓細(xì)胞中Gpx4靶向缺失的LysMcreGpx4fl/fl和CD64creGpx4fl/fl小鼠的BMDMs。流式細(xì)胞術(shù)分析，當(dāng)感染多重度（MOI）為5時，來自這些小鼠品系的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在第1天和第4天均顯示出Mtb誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡增強(qiáng)（圖6A-B）。這種增強(qiáng)的細(xì)胞壞死與線粒體超氧化物水平升高以及脂質(zhì)過氧化升高有關(guān)（圖6C-D），且導(dǎo)致細(xì)胞外環(huán)境中細(xì)菌負(fù)荷增強(qiáng)（圖6E）。有趣的是，當(dāng)MOI為1時，對感染Mtb的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在兩種條件敲除的巨噬細(xì)胞群體中，Gpx4表達(dá)的缺失也被發(fā)現(xiàn)與胞內(nèi)細(xì)菌生長增加有關(guān)。這種效應(yīng)被治療抑制ferrostatin-1（Fer-1；圖6F）。重要的是，在高M(jìn)OI的Mtb感染的Gpx4缺失巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中，F(xiàn)er-1的加入顯著抑制細(xì)胞壞死的增加（圖6G-I）。總之，這些體外觀察支持Gpx4在調(diào)節(jié)Mtb誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡中的主要作用，同時揭示該酶在控制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌生長方面的潛在功能。
圖6 Gpx4缺失在體外Mtb感染的巨噬細(xì)胞中觸發(fā)脂質(zhì)過氧化依賴性壞死和細(xì)菌控制的喪失
結(jié)論:
綜上所述，作者研究Gpx4調(diào)節(jié)的脂質(zhì)過氧化與mtb4感染人類以及小鼠肺結(jié)核實驗?zāi)Ｐ椭兴拗髂退幮院图膊〉年P(guān)系，并從Mtb4感染的NHPs肺切片中酶的組織染色中提供支持?jǐn)?shù)據(jù)。作者發(fā)現(xiàn)更嚴(yán)重疾病的患者表現(xiàn)出外周血單個核細(xì)胞循環(huán)單核細(xì)胞中GPX4表達(dá)減少，GSH減少以及血漿中脂質(zhì)過氧化物水平升高。進(jìn)一步證明，在體內(nèi)和體外，Gpx4表達(dá)的降低與壞死、脂質(zhì)過氧化和細(xì)菌生長的增加有關(guān)，而Gpx4表達(dá)的增強(qiáng)在體內(nèi)具有相反的結(jié)果。通過條件敲除小鼠以及體外感染實驗，揭示髓系細(xì)胞的Gpx4表達(dá)在決定這些結(jié)果中起著核心作用。這些發(fā)現(xiàn)支持鐵死亡在Mtb誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死中的作用，并暗示Gpx4/GSH軸是結(jié)核病的宿主定向治療的靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)
Amaral EP, Foreman TW, Namasivayam S, Hilligan KL, Kauffman KD, Barbosa Bomfim CC, et al. (2022). GPX4 regulates cellular necrosis and host resistance in Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med; 219(11):e20220504. doi: 10.1084/jem.20220504.