SDCBP-AS1通過調控hnRNP K的泛素化和SUMO化來破壞β-catenin的穩(wěn)定，從而抑制胃癌的發(fā)生和轉移

胃癌（GC）是全球癌癥相關死亡的主要原因，盡管其發(fā)病率因不同地理區(qū)域而異。盡管標準化治療在過去十年中提高了患者的生存率，但5年生存率仍然很低。早期發(fā)現(xiàn)可以在很大程度上提高5年生存率；然而，由于缺乏有效的診斷和治療策略，中國超過80%的GC患者在診斷時患有晚期疾病，5年生存率低于20%。因此，迫切需要新的生物標志物和治療靶點用于GC的診斷和預后預測，以降低死亡率。該研究發(fā)表于《Cancer Communications》，IF: 15.283。

技術路線：

主要研究結果：

1. GC組織中SDCBP2-AS1的下調表明結局不佳

作者研究了SDCBP2-AS1表達與臨床樣本不同臨床病理特征之間的潛在關聯(lián)。結果表明，與匹配的相鄰非腫瘤組織相比，GC組織中SDCBP2-AS1表達顯著降低（圖1A-B）。根據(jù)從截止查找器獲得的SDCBP2-AS1的臨界值（0.0058），將患者分為SDCBP2-AS1高表達組（n=59）和低表達組（n=73）。值得注意的是，SDCBP2-AS1的低表達與GC患者中腺癌（P=0.033）、腫瘤較大（P =0.016）、淋巴結轉移（P <0.001）、遠處轉移（P =0.036）和晚期病理性TNM（p<0.001）分期（P 0.001）有關。Kaplan-Meier生存分析顯示，低SDCBP2-AS1組的DFS和OS率低于高SDCBP2-AS1組（圖1C）。單因素和多因素分析表明，SDCBP2-AS1表達是GC的獨立預后因素。為了驗證這些發(fā)現(xiàn)，使用Kaplan-Meier繪圖儀使用數(shù)據(jù)集探索SDCBP2-AS1過表達與生存之間的潛在關聯(lián)GSE22377。結果表明，SDCBP2-AS1的低表達與較短的OS和DFS有關（圖1D）。這些發(fā)現(xiàn)證實，SDCBP2-AS1的低表達可預測GC患者的預后不良。

圖1 SDCBP2-AS1在GC組織中下調，表明患者預后不良

2. SDCBP2-AS1在體外抑制GC細胞的增殖和轉移

使用兩種shRNA在BGC823和MKN28細胞中敲低SDCBP2-AS1。SDCBP2-AS1在SGC7901細胞中過表達。RT-qPCR分析用于確定轉染的有效性。細胞增殖和集落形成測定表明，敲低SDCBP2-AS1顯著促進了兩種細胞系的增殖和集落形成（圖2A-B），而SCBP2-AS1的過表達具有相反的效果（圖2C-D)。進一步探討了SDCBP2-AS1對GC細胞轉移的影響。Transwell和傷口愈合測定的結果表明，SDCBP2-AS1的沉默增加了BGC823和MKN28細胞的遷移和侵襲（圖2E-F），而SDCBP2-AS1的過表達增強了SGC7901細胞的遷移率（圖2G-H)。這些體外數(shù)據(jù)表明，敲低SDCBP2-AS1積極促進GC細胞的增殖，遷移和侵襲。

圖2 SDCBP2-AS1在體外抑制GC細胞增殖和轉移

3. SDCBP2-AS1 抑制體內(nèi) GC 細胞的生長和轉移

使用體內(nèi)異種移植腫瘤和裸鼠肺轉移模型測定SDCBP2-AS1對GC細胞致瘤和轉移能力的影響。通過皮下注射穩(wěn)定轉染shSDCBP2-AS1#1（sh1）或NT對照的BGC823細胞建立異種移植腫瘤模型。由此產(chǎn)生的腫瘤明顯更大，并且在sh1組中表現(xiàn)出比NT組更快的生長（圖3A-C）。通過對Ki-67的H&E和IHC分析染色進一步證實了這種差異，結果表明，與NT組相比，sh1組在腫瘤組織中的Ki-67表達顯著增加（圖3D）。此外，肺轉移模型顯示，NT組的轉移性病變比sh1組少（圖3E-F）。通過對Ki-67的H&E和IHC分析對肺組織切片進行染色，進一步證實了這種差異（圖3G）。綜上所述，這些體內(nèi)結果支持SDCBP2-AS1在GC中的腫瘤抑制作用。

圖3 SDCBP2-AS1抑制體內(nèi)GC細胞的生長和轉移

3.4. SDCBP2-AS1 與細胞質中的 hnRNP K 相互作用

為了確定潛在的機制，使用RNA-FISH和RNA亞細胞分離研究了SDCBP2-AS1在GC細胞中的分布。結果表明，SDCBP2-AS1在細胞質中更為普遍（圖4A-B）。此外，使用生物素化SDCBP2-AS1進行RNA下拉測定法來鑒定SDCBP2-AS1的蛋白質伴侶。通過電泳分離回收的蛋白質并進行銀染。最后，選擇幾個差分帶進行質譜分析，證實hnRNP K與SDCBP2-AS1相互作用，但與反義SDCBP2-AS1不相互作用（圖4C-D）。接下來，體內(nèi)RIP分析顯示hnRNP K與BGC823細胞中的SDCBP2-AS1相互作用（圖4E）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)證明了SDCBP2-AS1和hnRNP K之間的相互作用。為了確定SDCBP2-AS1的哪些區(qū)域與hnRNP K結合，根據(jù)SDCBP2-AS1的預測二級結構構建了一系列SDCBP2-AS1缺失突變體（圖4F）。RNA片段在體外從RNA下拉測定的缺失構建體轉錄（圖4G）。不同 SDCBP2-AS1 RNA 片段拉下的蛋白質樣品中 hnRNP K 的免疫印跡分析表明，核苷酸 541-2479 缺失的 RNA 片段完全失去了與 hnRNP K 結合的能力（圖4H）。外顯子2的序列可以與hnRNP K相互作用，其RNA二級結構與SDCBP2-AS1的全長序列完全不同。因此，外顯子3序列被確定為SDCBP2-AS1和hnRNP K之間相互作用所必需的（圖4H）。此外，hnRNP K具有幾個參與RNA-蛋白質相互作用的功能結構域，據(jù)報道涉及三個K同源（KH）結構域（KH1，KH2和KH3）。然而，位于 KH2 和 KH3 結構域之間的 KI 結構域介導 hnRNP K 活性，盡管潛在機制尚不清楚。BGC823細胞中一系列標記的hnRNP K缺失突變體的RIP測定（圖4I-J）表明KH3與SDCBP2-AS1結合的能力最大，而其他結構域與SDCBP2-AS1相互作用的能力沒有顯著差異（圖4K）。這些結果確定了SDCBP2-AS1的特定區(qū)域，這些區(qū)域能夠與GC細胞中的hnRNP K蛋白結構域結合。

圖4 SDCBP2-AS1與細胞質中的hnRNP K相互作用

5. 沉默 SDCBP2-AS1 穩(wěn)定的β連環(huán)蛋白和禁止的轉錄活性

為了鑒定SDCBP2-AS1的推定靶標，進行了RNA測序以獲得敲低SDCBP2-AS1后BGC823細胞的轉錄譜。在301個差異表達基因中，SDCBP2-AS1敲低組有51個上調，250個下調（圖5A）。此外，RNA-seq數(shù)據(jù)的GSEA表明，SDCBP2-AS1的敲低與β-連環(huán)蛋白的過表達呈正相關（圖5B）。lncRNA的亞細胞定位與功能。SDCBP2-AS1主要位于細胞質中，與β連環(huán)蛋白表達相關，提示SDCBP2-AS1干擾β連環(huán)蛋白的降解。為了確認，蛋白質免疫印跡分析顯示，敲低SDCBP2-AS1顯著提高了BGC823和MKN28細胞中β連環(huán)蛋白和hnRNP K的蛋白水平，而過表達SDCBP2-AS1的SGC7901細胞的β-連環(huán)蛋白和hnRNP K的表達水平較低（圖5C）。此外，蛋白質印跡分析顯示，敲低SDCBP2-AS1導致細胞質中β連環(huán)蛋白的表達降低，細胞核中表達較高（圖5D）。hnRNP K的結果相反。IF測定的結果表明，SDCBP2-AS1改變了GC細胞中細胞核和細胞質之間β連環(huán)蛋白的穿梭（圖5E）。TOP/FOP閃光素酶測定的結果顯示，SDCBP2-AS1敲低細胞中激活了β連環(huán)蛋白信號傳導（圖5F）。此外，RT-qPCR和蛋白質印跡分析結果表明，SDCBP2-AS1的穩(wěn)定過表達或敲低改變了β連環(huán)蛋白下游基因（即CCND1、MYC和MMP7）的表達模式。β連環(huán)蛋白的易位激活了Wnt信號通路，特別是通過Wnt3a，而不是Wnt5a（圖5G-H）。綜上所述，這些結果表明，敲低SDCBP2-AS1有助于穩(wěn)定β連環(huán)蛋白并激活規(guī)范的Wnt信號通路。

圖5 SDCBP2-AS1的沉默穩(wěn)定β連環(huán)蛋白和禁止的轉錄活性

6. SDCBP2-AS1 通過阻斷 GC 細胞中 hnRNP K 的 SUMO化來破壞β連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性

由于發(fā)現(xiàn)SDCBP2-AS1在不同方向上調節(jié)β-連環(huán)蛋白和hnRNP K的蛋白質水平，SDCBP2-AS1也可能調節(jié)轉錄后修飾。因此，蛋白質合成抑制劑CHX用于評估SDCBP2-AS1對β連環(huán)蛋白穩(wěn)定性的影響。用CHX處理后，所有組中β連環(huán)蛋白的蛋白質合成均顯著下降，這意味著SDCBP2-AS1的敲低或SDCBP2-AS1的過表達不影響β連環(huán)蛋白的蛋白質合成（圖6A）。此外，與蛋白酶體抑制劑MG132孵育后，SDCBP2-AS1的敲低和過表達對GC細胞中β連環(huán)蛋白的降解具有相似的作用（圖6B）。SDCBP2-AS1調節(jié)β連環(huán)蛋白的降解，但不能調節(jié)合成。進行IP分析以確定SDCBP2-AS1是否參與形成靶向內(nèi)源性β連環(huán)蛋白的降解復合物。由于APC、Axin1和GSK3β是誘導β連環(huán)蛋白降解的主要成分，因此在沒有SDCBP2-AS1的情況下，β連環(huán)蛋白與破壞復合物之間的相互作用降低（圖6C），表明SDCBP2-AS1可能干擾β連環(huán)蛋白的降解。SDCBP2-AS1的過表達一致地促進了β連環(huán)蛋白的泛素化和降解（圖6C）通過與 hnRNP K 結合。在沒有SDCBP2-AS1的情況下，β連環(huán)蛋白的泛素化是不完全的（圖6D）。作者構建了一系列Flag標記截短的hnRNP K蛋白，蛋白質結構域圖譜研究表明，hnRNP K的KH3和KI結構域對于其與β連環(huán)蛋白的相互作用至關重要（圖6E）。同時，HA標記的β連環(huán)蛋白截斷突變體的免疫沉淀表明，β連環(huán)蛋白的所有結構域都參與其與hnRNP K的相互作用，盡管全長具有最大的結合能力（圖6F）。此外，SDCBP2-AS1主要與hnRNP K的KH3結構域相互作用。在KH3區(qū)域已經(jīng)報道了幾個翻譯后修飾位點，例如位于422位的賴氨酸殘基，它被確定為hnRNP K的主要SUMO化位點。因此，研究了SDCBP2-AS1調控hnRNP K翻譯后修飾的能力，特別是KH3結構域的SUMO化和泛素化。SDCBP2-AS1的敲低增加了野生型的SUMO化，但K422R突變體沒有增加（圖6G），以及 hnRNP K 的內(nèi)源性多泛素化減少（圖6H）。與K422R突變體相比，SDCBP2-AS1通過阻斷空間結構中KH3結構域的特定活性位點來改變SUMO化。這些結果表明，敲低SDCBP2-AS1導致β連環(huán)蛋白在細胞質中的積累，隨后通過穩(wěn)定GC細胞中的β連環(huán)蛋白進行核易位。

圖6 SDCBP2-AS1通過阻斷HNRNP K的SUMO化來破壞β連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性

7. SDCBP2-AS1 的腫瘤抑制功能通過與 hnRNP K 的相互作用部分發(fā)揮

建立具有穩(wěn)定敲低hnRNP K的SGC7901細胞，以評估GC細胞中SDCBP2-AS1和hnRNP K之間的相互作用。此外，SDCBP2-AS1被過度表達以確定hnRNP K是否是關鍵介質。沉默hnRNP K消除了SDCBP2-AS1的腫瘤抑制功能，包括細胞增殖和遷移（圖7A-C）。IF和蛋白質印跡測定的結果表明，如果沒有hnRNP K，SDCBP2-AS1無法促進GC細胞中β連環(huán)蛋白的核易位（圖7D-E）。此外，TOP/FOP-閃光素酶、qPCR 和蛋白質印跡測定的結果表明，如果沒有 hnRNP K，SDCBP2-AS1 無法激活下游靶基因和 Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的轉錄（圖7F-H）。在異種移植腫瘤模型中，SGC7901細胞中hnRNP K的穩(wěn)定敲低消除了SDCBP2-AS1過表達引起的生長速率和腫瘤重量的差異（圖7I-K）。

圖7 SDCBP2-AS1通過與hnRNP K的相互作用部分發(fā)揮腫瘤抑制功能

結論：

該研究報道了SDCBP2-AS1作為一種新型腫瘤抑制因子lncRNA，可抑制GC細胞的增殖和轉移。SDCBP2-AS1的腫瘤抑制功能通過直接與hnRNP K結合調節(jié)hnRNP K和β-連環(huán)蛋白的轉錄后修飾，從而促進β連環(huán)蛋白的降解。一致地，通過丟失 SDCBP2-AS1 穩(wěn)定β連環(huán)蛋白導致 GC 患者預后不良，表明 SDCBP2-AS1 可能是 GC 患者的潛在診斷和預后生物標志物。

示意圖：

說明SDCBP2-AS1誘導抑制GC腫瘤發(fā)生的機制：

參考文獻：

Han J, Nie M, Chen C, Cheng X, Guo T, Huangfu L, Li X, Du H, Xing X, Ji J. SDCBP-AS1 destabilizes β-catenin by regulating ubiquitination and SUMOylation of hnRNP K to suppress gastric tumorigenicity and metastasis. Cancer Commun (Lond). 2022;42(11):1141-1161. doi: 10.1002/cac2.12367.