SDCBP-AS1通過(guò)調(diào)控hnRNP K的泛素化和SUMO化來(lái)破壞β-catenin的穩(wěn)定，從而抑制胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移

胃癌（GC）是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，盡管其發(fā)病率因不同地理區(qū)域而異。盡管標(biāo)準(zhǔn)化治療在過(guò)去十年中提高了患者的生存率，但5年生存率仍然很低。早期發(fā)現(xiàn)可以在很大程度上提高5年生存率；然而，由于缺乏有效的診斷和治療策略，中國(guó)超過(guò)80%的GC患者在診斷時(shí)患有晚期疾病，5年生存率低于20%。因此，迫切需要新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)用于GC的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，以降低死亡率。該研究發(fā)表于《Cancer Communications》，IF: 15.283。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. GC組織中SDCBP2-AS1的下調(diào)表明結(jié)局不佳

作者研究了SDCBP2-AS1表達(dá)與臨床樣本不同臨床病理特征之間的潛在關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，與匹配的相鄰非腫瘤組織相比，GC組織中SDCBP2-AS1表達(dá)顯著降低（圖1A-B）。根據(jù)從截止查找器獲得的SDCBP2-AS1的臨界值（0.0058），將患者分為SDCBP2-AS1高表達(dá)組（n=59）和低表達(dá)組（n=73）。值得注意的是，SDCBP2-AS1的低表達(dá)與GC患者中腺癌（P=0.033）、腫瘤較大（P =0.016）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P <0.001）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P =0.036）和晚期病理性TNM（p<0.001）分期（P 0.001）有關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，低SDCBP2-AS1組的DFS和OS率低于高SDCBP2-AS1組（圖1C）。單因素和多因素分析表明，SDCBP2-AS1表達(dá)是GC的獨(dú)立預(yù)后因素。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，使用Kaplan-Meier繪圖儀使用數(shù)據(jù)集探索SDCBP2-AS1過(guò)表達(dá)與生存之間的潛在關(guān)聯(lián)GSE22377。結(jié)果表明，SDCBP2-AS1的低表達(dá)與較短的OS和DFS有關(guān)（圖1D）。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，SDCBP2-AS1的低表達(dá)可預(yù)測(cè)GC患者的預(yù)后不良。

圖1 SDCBP2-AS1在GC組織中下調(diào)，表明患者預(yù)后不良

2. SDCBP2-AS1在體外抑制GC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

使用兩種shRNA在BGC823和MKN28細(xì)胞中敲低SDCBP2-AS1。SDCBP2-AS1在SGC7901細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。RT-qPCR分析用于確定轉(zhuǎn)染的有效性。細(xì)胞增殖和集落形成測(cè)定表明，敲低SDCBP2-AS1顯著促進(jìn)了兩種細(xì)胞系的增殖和集落形成（圖2A-B），而SCBP2-AS1的過(guò)表達(dá)具有相反的效果（圖2C-D)。進(jìn)一步探討了SDCBP2-AS1對(duì)GC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。Transwell和傷口愈合測(cè)定的結(jié)果表明，SDCBP2-AS1的沉默增加了BGC823和MKN28細(xì)胞的遷移和侵襲（圖2E-F），而SDCBP2-AS1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了SGC7901細(xì)胞的遷移率（圖2G-H)。這些體外數(shù)據(jù)表明，敲低SDCBP2-AS1積極促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。

圖2 SDCBP2-AS1在體外抑制GC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

3. SDCBP2-AS1 抑制體內(nèi) GC 細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

使用體內(nèi)異種移植腫瘤和裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型測(cè)定SDCBP2-AS1對(duì)GC細(xì)胞致瘤和轉(zhuǎn)移能力的影響。通過(guò)皮下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shSDCBP2-AS1#1（sh1）或NT對(duì)照的BGC823細(xì)胞建立異種移植腫瘤模型。由此產(chǎn)生的腫瘤明顯更大，并且在sh1組中表現(xiàn)出比NT組更快的生長(zhǎng)（圖3A-C）。通過(guò)對(duì)Ki-67的H&E和IHC分析染色進(jìn)一步證實(shí)了這種差異，結(jié)果表明，與NT組相比，sh1組在腫瘤組織中的Ki-67表達(dá)顯著增加（圖3D）。此外，肺轉(zhuǎn)移模型顯示，NT組的轉(zhuǎn)移性病變比sh1組少（圖3E-F）。通過(guò)對(duì)Ki-67的H&E和IHC分析對(duì)肺組織切片進(jìn)行染色，進(jìn)一步證實(shí)了這種差異（圖3G）。綜上所述，這些體內(nèi)結(jié)果支持SDCBP2-AS1在GC中的腫瘤抑制作用。

圖3 SDCBP2-AS1抑制體內(nèi)GC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

3.4. SDCBP2-AS1 與細(xì)胞質(zhì)中的 hnRNP K 相互作用

為了確定潛在的機(jī)制，使用RNA-FISH和RNA亞細(xì)胞分離研究了SDCBP2-AS1在GC細(xì)胞中的分布。結(jié)果表明，SDCBP2-AS1在細(xì)胞質(zhì)中更為普遍（圖4A-B）。此外，使用生物素化SDCBP2-AS1進(jìn)行RNA下拉測(cè)定法來(lái)鑒定SDCBP2-AS1的蛋白質(zhì)伴侶。通過(guò)電泳分離回收的蛋白質(zhì)并進(jìn)行銀染。最后，選擇幾個(gè)差分帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，證實(shí)hnRNP K與SDCBP2-AS1相互作用，但與反義SDCBP2-AS1不相互作用（圖4C-D）。接下來(lái)，體內(nèi)RIP分析顯示hnRNP K與BGC823細(xì)胞中的SDCBP2-AS1相互作用（圖4E）。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)證明了SDCBP2-AS1和hnRNP K之間的相互作用。為了確定SDCBP2-AS1的哪些區(qū)域與hnRNP K結(jié)合，根據(jù)SDCBP2-AS1的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一系列SDCBP2-AS1缺失突變體（圖4F）。RNA片段在體外從RNA下拉測(cè)定的缺失構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄（圖4G）。不同 SDCBP2-AS1 RNA 片段拉下的蛋白質(zhì)樣品中 hnRNP K 的免疫印跡分析表明，核苷酸 541-2479 缺失的 RNA 片段完全失去了與 hnRNP K 結(jié)合的能力（圖4H）。外顯子2的序列可以與hnRNP K相互作用，其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與SDCBP2-AS1的全長(zhǎng)序列完全不同。因此，外顯子3序列被確定為SDCBP2-AS1和hnRNP K之間相互作用所必需的（圖4H）。此外，hnRNP K具有幾個(gè)參與RNA-蛋白質(zhì)相互作用的功能結(jié)構(gòu)域，據(jù)報(bào)道涉及三個(gè)K同源（KH）結(jié)構(gòu)域（KH1，KH2和KH3）。然而，位于 KH2 和 KH3 結(jié)構(gòu)域之間的 KI 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo) hnRNP K 活性，盡管潛在機(jī)制尚不清楚。BGC823細(xì)胞中一系列標(biāo)記的hnRNP K缺失突變體的RIP測(cè)定（圖4I-J）表明KH3與SDCBP2-AS1結(jié)合的能力最大，而其他結(jié)構(gòu)域與SDCBP2-AS1相互作用的能力沒(méi)有顯著差異（圖4K）。這些結(jié)果確定了SDCBP2-AS1的特定區(qū)域，這些區(qū)域能夠與GC細(xì)胞中的hnRNP K蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

圖4 SDCBP2-AS1與細(xì)胞質(zhì)中的hnRNP K相互作用

5. 沉默 SDCBP2-AS1 穩(wěn)定的β連環(huán)蛋白和禁止的轉(zhuǎn)錄活性

為了鑒定SDCBP2-AS1的推定靶標(biāo)，進(jìn)行了RNA測(cè)序以獲得敲低SDCBP2-AS1后BGC823細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。在301個(gè)差異表達(dá)基因中，SDCBP2-AS1敲低組有51個(gè)上調(diào)，250個(gè)下調(diào)（圖5A）。此外，RNA-seq數(shù)據(jù)的GSEA表明，SDCBP2-AS1的敲低與β-連環(huán)蛋白的過(guò)表達(dá)呈正相關(guān)（圖5B）。lncRNA的亞細(xì)胞定位與功能。SDCBP2-AS1主要位于細(xì)胞質(zhì)中，與β連環(huán)蛋白表達(dá)相關(guān)，提示SDCBP2-AS1干擾β連環(huán)蛋白的降解。為了確認(rèn)，蛋白質(zhì)免疫印跡分析顯示，敲低SDCBP2-AS1顯著提高了BGC823和MKN28細(xì)胞中β連環(huán)蛋白和hnRNP K的蛋白水平，而過(guò)表達(dá)SDCBP2-AS1的SGC7901細(xì)胞的β-連環(huán)蛋白和hnRNP K的表達(dá)水平較低（圖5C）。此外，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，敲低SDCBP2-AS1導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中β連環(huán)蛋白的表達(dá)降低，細(xì)胞核中表達(dá)較高（圖5D）。hnRNP K的結(jié)果相反。IF測(cè)定的結(jié)果表明，SDCBP2-AS1改變了GC細(xì)胞中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間β連環(huán)蛋白的穿梭（圖5E）。TOP/FOP閃光素酶測(cè)定的結(jié)果顯示，SDCBP2-AS1敲低細(xì)胞中激活了β連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)（圖5F）。此外，RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果表明，SDCBP2-AS1的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或敲低改變了β連環(huán)蛋白下游基因（即CCND1、MYC和MMP7）的表達(dá)模式。β連環(huán)蛋白的易位激活了Wnt信號(hào)通路，特別是通過(guò)Wnt3a，而不是Wnt5a（圖5G-H）。綜上所述，這些結(jié)果表明，敲低SDCBP2-AS1有助于穩(wěn)定β連環(huán)蛋白并激活規(guī)范的Wnt信號(hào)通路。

圖5 SDCBP2-AS1的沉默穩(wěn)定β連環(huán)蛋白和禁止的轉(zhuǎn)錄活性

6. SDCBP2-AS1 通過(guò)阻斷 GC 細(xì)胞中 hnRNP K 的 SUMO化來(lái)破壞β連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性

由于發(fā)現(xiàn)SDCBP2-AS1在不同方向上調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白和hnRNP K的蛋白質(zhì)水平，SDCBP2-AS1也可能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后修飾。因此，蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX用于評(píng)估SDCBP2-AS1對(duì)β連環(huán)蛋白穩(wěn)定性的影響。用CHX處理后，所有組中β連環(huán)蛋白的蛋白質(zhì)合成均顯著下降，這意味著SDCBP2-AS1的敲低或SDCBP2-AS1的過(guò)表達(dá)不影響β連環(huán)蛋白的蛋白質(zhì)合成（圖6A）。此外，與蛋白酶體抑制劑MG132孵育后，SDCBP2-AS1的敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)GC細(xì)胞中β連環(huán)蛋白的降解具有相似的作用（圖6B）。SDCBP2-AS1調(diào)節(jié)β連環(huán)蛋白的降解，但不能調(diào)節(jié)合成。進(jìn)行IP分析以確定SDCBP2-AS1是否參與形成靶向內(nèi)源性β連環(huán)蛋白的降解復(fù)合物。由于APC、Axin1和GSK3β是誘導(dǎo)β連環(huán)蛋白降解的主要成分，因此在沒(méi)有SDCBP2-AS1的情況下，β連環(huán)蛋白與破壞復(fù)合物之間的相互作用降低（圖6C），表明SDCBP2-AS1可能干擾β連環(huán)蛋白的降解。SDCBP2-AS1的過(guò)表達(dá)一致地促進(jìn)了β連環(huán)蛋白的泛素化和降解（圖6C）通過(guò)與 hnRNP K 結(jié)合。在沒(méi)有SDCBP2-AS1的情況下，β連環(huán)蛋白的泛素化是不完全的（圖6D）。作者構(gòu)建了一系列Flag標(biāo)記截短的hnRNP K蛋白，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域圖譜研究表明，hnRNP K的KH3和KI結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄渑cβ連環(huán)蛋白的相互作用至關(guān)重要（圖6E）。同時(shí)，HA標(biāo)記的β連環(huán)蛋白截?cái)嗤蛔凅w的免疫沉淀表明，β連環(huán)蛋白的所有結(jié)構(gòu)域都參與其與hnRNP K的相互作用，盡管全長(zhǎng)具有最大的結(jié)合能力（圖6F）。此外，SDCBP2-AS1主要與hnRNP K的KH3結(jié)構(gòu)域相互作用。在KH3區(qū)域已經(jīng)報(bào)道了幾個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)，例如位于422位的賴氨酸殘基，它被確定為hnRNP K的主要SUMO化位點(diǎn)。因此，研究了SDCBP2-AS1調(diào)控hnRNP K翻譯后修飾的能力，特別是KH3結(jié)構(gòu)域的SUMO化和泛素化。SDCBP2-AS1的敲低增加了野生型的SUMO化，但K422R突變體沒(méi)有增加（圖6G），以及 hnRNP K 的內(nèi)源性多泛素化減少（圖6H）。與K422R突變體相比，SDCBP2-AS1通過(guò)阻斷空間結(jié)構(gòu)中KH3結(jié)構(gòu)域的特定活性位點(diǎn)來(lái)改變SUMO化。這些結(jié)果表明，敲低SDCBP2-AS1導(dǎo)致β連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的積累，隨后通過(guò)穩(wěn)定GC細(xì)胞中的β連環(huán)蛋白進(jìn)行核易位。

圖6 SDCBP2-AS1通過(guò)阻斷HNRNP K的SUMO化來(lái)破壞β連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性

7. SDCBP2-AS1 的腫瘤抑制功能通過(guò)與 hnRNP K 的相互作用部分發(fā)揮

建立具有穩(wěn)定敲低hnRNP K的SGC7901細(xì)胞，以評(píng)估GC細(xì)胞中SDCBP2-AS1和hnRNP K之間的相互作用。此外，SDCBP2-AS1被過(guò)度表達(dá)以確定hnRNP K是否是關(guān)鍵介質(zhì)。沉默hnRNP K消除了SDCBP2-AS1的腫瘤抑制功能，包括細(xì)胞增殖和遷移（圖7A-C）。IF和蛋白質(zhì)印跡測(cè)定的結(jié)果表明，如果沒(méi)有hnRNP K，SDCBP2-AS1無(wú)法促進(jìn)GC細(xì)胞中β連環(huán)蛋白的核易位（圖7D-E）。此外，TOP/FOP-閃光素酶、qPCR 和蛋白質(zhì)印跡測(cè)定的結(jié)果表明，如果沒(méi)有 hnRNP K，SDCBP2-AS1 無(wú)法激活下游靶基因和 Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的轉(zhuǎn)錄（圖7F-H）。在異種移植腫瘤模型中，SGC7901細(xì)胞中hnRNP K的穩(wěn)定敲低消除了SDCBP2-AS1過(guò)表達(dá)引起的生長(zhǎng)速率和腫瘤重量的差異（圖7I-K）。

圖7 SDCBP2-AS1通過(guò)與hnRNP K的相互作用部分發(fā)揮腫瘤抑制功能

結(jié)論：

該研究報(bào)道了SDCBP2-AS1作為一種新型腫瘤抑制因子lncRNA，可抑制GC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。SDCBP2-AS1的腫瘤抑制功能通過(guò)直接與hnRNP K結(jié)合調(diào)節(jié)hnRNP K和β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾，從而促進(jìn)β連環(huán)蛋白的降解。一致地，通過(guò)丟失 SDCBP2-AS1 穩(wěn)定β連環(huán)蛋白導(dǎo)致 GC 患者預(yù)后不良，表明 SDCBP2-AS1 可能是 GC 患者的潛在診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。

示意圖：

說(shuō)明SDCBP2-AS1誘導(dǎo)抑制GC腫瘤發(fā)生的機(jī)制：

參考文獻(xiàn)：

Han J, Nie M, Chen C, Cheng X, Guo T, Huangfu L, Li X, Du H, Xing X, Ji J. SDCBP-AS1 destabilizes β-catenin by regulating ubiquitination and SUMOylation of hnRNP K to suppress gastric tumorigenicity and metastasis. Cancer Commun (Lond). 2022;42(11):1141-1161. doi: 10.1002/cac2.12367.