NLRP6促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移仍然是小細(xì)胞肺癌(SCLC)相關(guān)死亡的主要原因。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤轉(zhuǎn)移與以抗炎反應(yīng)、免疫抑制和腫瘤來(lái)源的外泌體存在為特征的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境有關(guān)。為了闡明這些因素在SCLC中的關(guān)系，我們分析了SCLC患者樣本和小鼠模型。我們發(fā)現(xiàn)，M2 TAM標(biāo)記CD206+的高表達(dá)與SCLC患者較差的預(yù)后和轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)。此外，在SCLC小鼠模型的轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞(M?)。我們觀(guān)察到M2極化，并伴有NLRP6表達(dá)的增加。我們的研究結(jié)果首次表明SCLC來(lái)源的外泌體通過(guò)NLRP6/NF-κB通路誘導(dǎo)M2開(kāi)關(guān)，從而促進(jìn)SCLC在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明了一種新的機(jī)制，SCLC來(lái)源的外泌體通過(guò)激活NLRP6誘導(dǎo)遠(yuǎn)處M?的免疫抑制，進(jìn)而促進(jìn)全身轉(zhuǎn)移。在這里，我們強(qiáng)調(diào)了腫瘤來(lái)源的外泌體、炎癥小體和免疫微環(huán)境在SCLC轉(zhuǎn)移中的密切關(guān)系。本文于2022年10月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF= 9.685）上。

技術(shù)路線(xiàn)

結(jié)果

1）M2 TAMs與SCLC患者轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)

我們?cè)诨颊叩哪[瘤組織切片中分析TAM標(biāo)記物CD68和M2標(biāo)記物CD206的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)CD68+和CD206+ M?主要位于腫瘤間質(zhì)。CD68表達(dá)水平無(wú)明顯差異。然而，CD206在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)明顯高于沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(圖A)。在此之后，我們統(tǒng)計(jì)了CD206+ TAM的數(shù)量。根據(jù)中位數(shù)，將患者分為CD206+ TAM低表達(dá)和高表達(dá)兩組。腫瘤間質(zhì)中，高水平的CD206與轉(zhuǎn)移和NLRP6高表達(dá)相關(guān)(圖1B，C)。CD206的高表達(dá)也與OS降低相關(guān)(圖1D)。數(shù)據(jù)的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析表明CD206是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(圖2)。綜上所述，這些結(jié)果表明M2 TAMs是SCLC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

2）在SCLC裸鼠模型中，NLRP6在轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)升高

炎癥微環(huán)境是惡性腫瘤免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素。我們分析了GSE116977?；蚣患治?GSEA)顯示，與轉(zhuǎn)移部位相比，原發(fā)部位的炎癥反應(yīng)通路顯著富集(圖3A)，表明轉(zhuǎn)移部位的免疫抑制。此外，包括NLRP6在內(nèi)的幾種炎癥小體在原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移腫瘤中表達(dá)水平不同。M2 M?標(biāo)記CD163和IL10在轉(zhuǎn)移部位上調(diào)，而M1標(biāo)記、NOS2和IL6下調(diào)(圖3B)。我們還分析了從RT SCLC尾靜脈注射的同種異體移植模型中分離出來(lái)的肺腫瘤(圖3C)。結(jié)果表明，與未注射SCLC細(xì)胞的小鼠相比，注射SCLC細(xì)胞的小鼠M?和M2 M?的比例都更高(圖3D)。為了估計(jì)炎癥小體蛋白水平的變化，我們對(duì)AIM2、NLRP1、NLRP3、NLRP6和NLRP9進(jìn)行了qRT-PCR和western blotting分析。令人驚訝的是，與癌旁組織相比，NLRP6在癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)(圖3E，F(xiàn))。這些結(jié)果表明NLRP6可能與SCLC的M?極化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

3）SCLC細(xì)胞通過(guò)外泌體分泌調(diào)節(jié)BMDMs的M2極化

為了確定M?極化是否由SCLC細(xì)胞誘導(dǎo)，我們聯(lián)合培養(yǎng)了BMDMs和小鼠RT SCLC細(xì)胞。與SCLC細(xì)胞共孵育48小時(shí)后，收集BMDMs進(jìn)行分析。流式細(xì)胞儀和qRT-PCR分析顯示M2標(biāo)記物Arg-1和CD206的表達(dá)顯著升高。相比之下，M1標(biāo)記物CD86和NOS2的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。此外，他們表達(dá)了較高水平的M2標(biāo)記物IL10(圖4A-C)。然后我們研究了SCLC細(xì)胞在不直接接觸的情況下影響BMDM的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)在DMA治療后的BMDMs中，M?表型轉(zhuǎn)換為M2(圖4D，E)。為了確定腫瘤來(lái)源的外泌體與觀(guān)察到的表型轉(zhuǎn)換有關(guān)，將從SCLC細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出的外泌體(圖4F)添加到BMDMs中，共培養(yǎng)48 h。對(duì)上述標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，來(lái)自SCLC的外泌體足以將BMDMs轉(zhuǎn)換為M2表型(圖4G-I)。因此，這些數(shù)據(jù)表明SCLC來(lái)源的外泌體將M?群體極化為Arg1⁺CD206⁺ M2。

4）SCLC來(lái)源的外泌體對(duì)TAM極化的調(diào)控依賴(lài)于NLRP6/NF-κB通路

NLRP6先前已被證明可以抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng)?？紤]到上述發(fā)現(xiàn)，我們假設(shè)SCLC來(lái)源的外泌體通過(guò)NLRP6途徑促進(jìn)TAM極化。通過(guò)qRT-PCR和western blotting檢測(cè)NLRP6在BMDMs共培養(yǎng)后的表達(dá)變化。在與RT SCLC細(xì)胞或外泌體直接共培養(yǎng)后，NLRP6在BMDMs中的表達(dá)顯著升高。同時(shí)，DMA培養(yǎng)可逆轉(zhuǎn)這種表型(圖5A, B)。由于NLRP6負(fù)向調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，我們檢測(cè)了共培養(yǎng)BMDMs中p65和IκB的水平。在總p65和IκB水平保持不變的情況下，磷酸化p65和磷酸化IκB水平顯著下降，表明NLRP6可能負(fù)向調(diào)控了NF-κB的激活。外泌體提取前的DMA處理逆轉(zhuǎn)了對(duì)磷酸化IκB和磷酸化p65的作用(圖5C)。因此，在SCLC腫瘤來(lái)源的外泌體誘導(dǎo)的M?極化中，NF-κB是NLRP6的關(guān)鍵下游因子。為了進(jìn)一步研究腫瘤來(lái)源的外泌體、NLRP6表達(dá)和M?表型開(kāi)關(guān)之間的相關(guān)性，我們通過(guò)siRNA沉默降低了BMDMs中的NLRP6表達(dá)。通過(guò)western blotting和qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染效率(圖5D)。與上述結(jié)果一致，敲低NLRP6可以促進(jìn)IκB和p65的磷酸化(圖5E)。此外，在SCLC來(lái)源的外泌體處理后，敲除組的BMDMs未能切換到M2表型(圖5F-H)。敲低組和陰性對(duì)照組M1標(biāo)記物的水平也相當(dāng)(圖5F-H)?？傊?，這些結(jié)果支持SCLC來(lái)源的外泌體通過(guò)NLRP6/NF-κB通路促進(jìn)M?中的M2開(kāi)關(guān)的觀(guān)點(diǎn)。

5）SCLC來(lái)源的外泌體促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SCLC來(lái)源的外泌體對(duì)M2 M?極化的影響，在裸鼠體內(nèi)注射外泌體1周后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。與注射PBS的對(duì)照組相比，外泌體處理的小鼠肺和脾臟中CD206+ M?的比例明顯更高(圖6A)。為了確定SCLC來(lái)源的外泌體是否促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移，將小鼠RT SCLC細(xì)胞分離的外泌體靜脈注射到SCLC尾靜脈注射的異體移植物模型中(圖6B)。4周后，統(tǒng)計(jì)肺部腫瘤的數(shù)量。外泌體治療組的肺SCLC腫瘤數(shù)量明顯高于對(duì)照組。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，外泌體處理組NLRP6和p65磷酸化水平升高(圖6C-F)。

結(jié)論：

我們的研究揭示了SCLC來(lái)源的外泌體與M?表型切換的關(guān)系，其涉及NLRP6/ NF-κB通路的激活，從而促進(jìn)SCLC的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。本研究對(duì)炎癥因子的研究為預(yù)防SCLC轉(zhuǎn)移提供了新的方向。

參考文獻(xiàn)：

Rao X, Zhou X, Wang G, Jie X, Xing B, Xu Y, Chen Y, Li J, Zhu K, Wu Z, Wu G, Wu C, Zhou R. NLRP6 is required for cancer-derived exosome-modified macrophage M2 polarization and promotes metastasis in small cell lung cancer. Cell Death Dis. 2022 Oct 21;13(10):891. doi: 10.1038/s41419-022-05336-0.