乳酸-NAD+軸通過下調p62激活腫瘤相關成纖維細胞

p62水平降低與癌癥相關成纖維細胞(CAF)表型的誘導相關，CAF表型通過炎癥和代謝重編程在體內外促進腫瘤發(fā)生。然而，腫瘤細胞如何下調基質成纖維細胞中的p62來驅動CAF激活是該領域尚未解決的核心問題。近日，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤分泌的乳酸下調了間質成纖維細胞中的p62；乳酸降低NAD+水平和PARP-1活性，從而下調間質p62；AP-1對乳酸誘導的間質成纖維細胞p62損失至關重要；PARP-1抑制劑(奧拉帕利)通過p62促進間質成纖維細胞的結締組織反應。該研究探究了癌細胞促進前致瘤性CAF表型的分子機制，為抑制CAF活性提供新的治療策略。該研究于2022年5月發(fā)表在《CELL REPORTS》，IF：9.995。

技術路線：

主要研究結果：

1. 前列腺癌細胞分泌一種可溶性因子，可降低基質成纖維細胞中p62的表達

為了研究p62在腫瘤間質中表達下調的機制，作者建立了小鼠GFP標記的前列腺基質細胞(mPSCs)與TRAMPC2前列腺癌(PCa)上皮細胞混合的體外細胞系統(tǒng)。與腫瘤細胞孵育時，基質細胞中Sqstm1(編碼p62) mRNA水平降低，這也與真正CAF標志物(如Tgfb1和Sdf-1)的增加相關(圖1A)。為了驗證p62的下調是否需要腫瘤細胞和基質細胞之間的細胞接觸，將人前列腺基質成纖維細胞(WPMY-1)與不同的PCa細胞系在雙腔環(huán)境中共培養(yǎng)。在這些條件下，基質細胞中p62的蛋白和mRNA水平也下調(圖1B和圖1C)，表明由PCa上皮細胞分泌的可溶性因子足以下調基質細胞中的p62。來自PCa細胞的條件培養(yǎng)基(CM)孵育基質細胞有效降低了基質細胞中的p62蛋白和mRNA水平，而正常前列腺上皮細胞(PrEC或RWEP1)的CM沒有任何影響(圖1D和1E)。為了確定SQSTM1 mRNA的減少是否是由于轉錄活性的抑制，使用了SQSTM1啟動子控制下的熒光素酶報告基因。PCa CM降低了熒光素酶報告的活性(圖1F)，表明基質p62的下調是通過腫瘤細胞分泌的可溶性因子抑制SQSTM1啟動子介導的。為了鑒定這種假定的腫瘤來源的可溶性因子，對PC3細胞的CM進行了大小分級。在成纖維細胞中，未分割的腫瘤CM和<3-kDa片段均在蛋白和mRNA水平上下調p62(圖1G和1H)，以及SQSTM1啟動子驅動的熒光素酶報告基因的活性(圖1I)。然而，>3-kDa部分在這些試驗中完全不活躍(圖1G-1I)?；钚钥扇苄砸蜃泳哂袩岱€(wěn)定性(圖1J-1L)，提示其可能為代謝物。

圖1 PCa細胞分泌一種可溶性因子，可降低基質細胞中p62的表達

2. 乳酸下調間質成纖維細胞中的p62

由于癌細胞分泌大量的乳酸，并且由于Warburg效應在TME中積累，推測乳酸可能是導致p62下調的代謝物。正如預期的那樣，PCa細胞系分泌的乳酸量高于正常前列腺上皮細胞(圖2A)。由于乳酸的細胞攝取是由不同的單羧酸轉運蛋白(MCT1、MCT2、MCT3和MCT4)介導的，接下來測試了阻斷這些轉運蛋白是否可以損害乳酸誘導的p62下調。MCT1在WPMY-1細胞中控制乳酸的細胞輸入，敲低MCT1導致PC3細胞的CM誘導的p62下調受到抑制(圖2B-2D)。同樣，當PC3細胞中控制乳酸輸出的MCT4被敲低時，WPMY-1細胞中p62的下調也被消除(圖2E-2G和S1B)。MCT1抑制劑AZD3965處理PC3 CM處理的WPMY-1細胞后，p62下調受損(圖2H-2J)。這些結果表明，PCa細胞分泌乳酸和基質細胞攝取乳酸是基質p62下調的關鍵步驟。為了證明乳酸足以下調成纖維細胞中的p62，將WPMY-1細胞與不同濃度的乳酸孵育24或48小時，這導致p62以時間和劑量依賴的方式下調(圖2K-2N)。在基質細胞中下調p62所需的乳酸量(圖2M和2N)與PCa細胞分泌的乳酸量(圖2A)相似，也與體內腫瘤的乳酸量相似。然而，簡單的培養(yǎng)基酸化不足以下調p62(圖2O)。這些結果表明，上皮PCa細胞分泌的乳酸在轉錄水平上損害了基質細胞中p62的表達。

圖2 乳酸下調p62

3. AP-1通過乳酸抑制p62下調

為了闡明乳酸下調基質p62的機制，下一步通過轉座酶可及染色質測序全基因組分析(ATAC-seq)研究了乳酸處理的成纖維細胞的染色質可及性。這項分析顯示，在乳酸處理的細胞中，染色質可及性普遍降低(圖3A)。HOMER(基序富集的超幾何優(yōu)化)分析表明，在乳酸處理的細胞的封閉染色質區(qū)域中，AP-1轉錄因子顯著富集(圖3B)。對SQSTM1啟動子的分析表明存在三個AP-1調節(jié)位點，這些位點也表明在乳酸處理的條件下染色質可及性降低(圖3C)。與此一致，乳酸抑制了AP-1驅動的熒光素酶報告基因(圖3D)，這共同表明SQSTM1啟動子中AP-1位點的抑制可以解釋乳酸對基質p62表達的影響。

為了確定AP-1位點在SQSTM1啟動子中的作用，分別突變了這些位點(AP-1A, AP-1B和AP-1C)，并確定這些突變對SQSTM1啟動子活性的影響。AP-1A的突變使SQSTM1啟動子完全失活，達到與乳酸產生的水平相當?shù)乃?，而AP-1B或AP-1C的突變沒有影響(圖3E)，這表明AP-1A是SQSTM1啟動子中介導乳酸抑制的關鍵增強子元件。為了驗證這一假設，通過CRISPR-Cas9編輯選擇性地刪除內源性SQSTM1啟動子中的AP-1A元件，從而產生4種獨立的WPMY-1細胞培養(yǎng)物(sgAP-1A)，這導致p62 mRNA和蛋白表達受到抑制(圖3F-3H)。這些結果確立了AP-1A在基質細胞中調節(jié)p62表達的相關性。與這一觀點一致， ChIP分析表明，乳酸顯著減少了c-FOS和c-JUN募集到AP-1A調節(jié)位點，但沒有減少FOSB或JUNB的募集，且未檢測到與AP-1B或AP-1C位點的結合發(fā)生變化(圖3I)。下調c-FOS、c-JUN和JNK，或者用JNK的兩種藥理抑制劑抑制c-JUN磷酸化，在蛋白和mRNA水平上模擬了乳酸對p62表達的影響(圖3J-3M)。這些數(shù)據(jù)表明，c-JUN/c-FOS AP-1轉錄復合物募集受損在乳酸誘導的基質p62下調中起關鍵作用。

圖3 AP-1通過乳酸抑制p62的下調

4. 乳酸代謝降低NAD+水平介導p62下調

研究成纖維細胞中細胞外乳酸的命運。應用2H和13C同位素示蹤和質譜方法來量化細胞外乳酸對NADH和中心碳代謝的貢獻。細胞外乳酸通過LDH活性代謝，將氫原子貢獻到NADH池并再生胞質煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)池(圖4A和4B)。接下來，發(fā)現(xiàn)大約20%的[13C]乳酸示蹤劑在三羧酸(TCA)循環(huán)中間產物上，這表明細胞外乳酸被代謝為促進線粒體TCA循環(huán)代謝的碳源(圖4A和圖4C)。測定在10 mM外源[13C]乳酸存在下的乳酸攝取和分泌通量的實驗表明，WPMY-1細胞在分泌未標記的乳酸的同時攝取標記的乳酸(圖4A和圖4D)。這些結果與以下事實一致：乳酸可以可逆性地轉化為丙酮酸鹽，隨后NAD+水平減少，有利于NADH的生成。增加培養(yǎng)基中丙酮酸的水平，使這一反應向相反的方向發(fā)生，顯然損害了乳酸下調p62的能力(圖4E和圖4F)。因此，NAD+/NADH比率的變化可能有助于乳酸調節(jié)p62水平的作用機制。與這一假設一致，乳酸處理的基質成纖維細胞中的NAD+水平低于未處理的細胞(圖4G)。使用NAD+或NAD+前體煙酰胺核苷(NR)治療完全挽救了乳酸誘導的p62減少，且獨立于自噬(圖4H-4K)。

圖4 乳酸改變NAD+/NADH水平介導p62下調

5. 乳酸抑制PARP-1可下調間質細胞p62

NAD+是三種轉錄和翻譯后調節(jié)因子的輔因子，包括sirtuins (SIRT1到SIRT7)、cyclic ADP-核糖合酶(CD38和CD157)和PARPs (PARP-1/2)。其中，只有PARP-1的敲低或CRISPR-Cas9缺失完全模擬了乳酸對p62表達的影響(圖5A -5E)。此外，PARP-1抑制劑PJ34或奧拉帕利也以劑量依賴性方式降低了p62的表達(圖5F-5I)。PARP-1除了在DNA損傷修復(DNA damage repair, DDR)中發(fā)揮眾所周知的作用外，還控制許多其他的生物過程，包括轉錄。此外，奧拉帕利抑制了c-FOS和c-JUN向SQSTM1啟動子中AP-1A結合位點的募集(圖5J和圖5K)。這些結果表明，基質細胞中乳酸代謝觸發(fā)的NAD+水平的變化對PARP-1活性的調節(jié)是p62下調的工具。因此，我們假設乳酸可以影響PARP-1的活化，從而影響c-JUN和c-FOS的聚腺苷二磷酸核糖基化。乳酸處理的細胞總poly(ADP-ribosyl)ation水平降低，c-JUN和c-FOS的poly(ADP-ribosyl)ation受損(圖5L-5N)。在乳酸處理的細胞中添加NAD+可恢復這兩種轉錄因子的poly(ADP-ribosyl)ation (圖5O和5P)，以及它們向SQSTM1啟動子中AP-1調節(jié)位點的募集(圖5Q和5R)。這些數(shù)據(jù)表明，乳酸代謝導致的NAD+耗損以及隨后c-FOS和c-JUN的poly(ADP-ribosyl)ation受損是乳酸下調基質成纖維細胞中p62的機制基礎。

圖5 抑制PARP-1可下調間質細胞p62水平

6. AP-1在p62缺失驅動的CAF激活中至關重要

p62缺失可驅動基質細胞中的CAF表型，從而促進腫瘤進展。由于PCa細胞的乳酸分泌對于下調基質中的p62是必要和充分的，因此下一步確定乳酸是否驅動CAF表型。乳酸處理成纖維細胞增加了CAF活化的真正標志物的表達，如ACTA2和TGF-β，這些標志物的表達被添加NAD+逆轉(圖6A和6B)。對乳酸處理的細胞中差異表達基因的基因集富集分析(GSEA)顯示，來自人類基質PCa數(shù)據(jù)集(GEO: GSE34312)的CAF signatures富集(圖6C)。此外，SQSTM1啟動子內源性失活的sgAP-1A成纖維細胞也顯示出CAF標志物表達增加(圖6D)。同樣，在雙腔共培養(yǎng)系統(tǒng)中，成纖維細胞sgAP-1A促進PC3細胞的遷移和侵襲，而sgC沒有作用(圖6E-6G)。PC3細胞與sgC和sgAP-1A成纖維細胞共培養(yǎng)表明，與sgC細胞相比，sgAP-1A細胞增強了PCa上皮細胞的侵襲和增殖指數(shù)(圖6H和6I)。此外，與sgC成纖維細胞共植入相比，PC3細胞與sgAP-1A成纖維細胞共植入皮下異種移植導致腫瘤生長增加(圖6J-6L)。由sgAP-1A成纖維細胞生成的腫瘤顯示基質活化標志物增加，如膠原沉積、透明質酸(HA)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(圖6M)。這些結果證實SQSTM1啟動子中的AP-1調節(jié)位點是乳酸驅動信號的靶點，并且在基質細胞內源性p62水平的控制中具有關鍵作用，對CAF表型的誘導至關重要。

圖6 AP-1控制基質細胞中SQSTM1啟動子對PCa腫瘤的生長和侵襲至關重要

7. PARP-1抑制劑通過p62促進間質成纖維細胞的結締組織反應

根據(jù)作者的模型，乳酸通過抑制PARP-1觸發(fā)基質成纖維細胞中p62的下調。同樣，通過CRISPR-Cas9敲除PARP-1模擬了乳酸的作用，并誘導了ACTA2和TGF-β等CAF活化標志物(圖7A)。因此，假設PARP-1抑制劑(如奧拉帕利)足以誘導基質激活。奧拉帕利降低了SQSTM1 mRNA，并上調了ACTA2、SFRP1、TGF-β、MMP9和HA合酶等CAF標志物(圖7B)。此外，對奧拉帕利處理的細胞進行的ATAC-seq分析表明，與乳酸處理相似，整個基因組中，在AP-1轉錄因子(包括SQSTM1啟動子)的共有基序區(qū)域，染色質可及性顯著降低(圖7C)。PC3細胞與奧拉帕利預處理的WPMY-1細胞共培養(yǎng)導致PCa細胞在基礎條件下的遷移和侵襲增加，這一情況在雄激素剝奪(ADT)下更為明顯(圖7D-7F)。此外，奧拉帕利處理的WPMY-1 CM導致PC3增殖增加(圖7G和7H)。根據(jù)這些觀察結果，假設奧拉帕利治療后基質激活可能會抑制其抗腫瘤活性。為了檢驗這一假設，在基礎或ADT條件下將GFP標記的PC3細胞(PC3GFP)與WPMY-1細胞(共培養(yǎng))或不與WPMY-1細胞(單獨培養(yǎng))共培養(yǎng)，并且使用或不使用奧拉帕利治療10日(圖7I)。與單獨培養(yǎng)條件下的處理相比，與WPMY-1細胞共培養(yǎng)使PC3GFP細胞對奧拉帕利具有更高的耐藥性(圖7J)。這一效應在ADT條件下更加明顯(圖7J)。為了研究奧拉帕利的體內前CAF表型，下一步在NOD scid γ (NSG)小鼠中共植入PC3和WPMY-1細胞，并使用溶劑或奧拉帕利對它們進行處理(圖7K)。體內奧拉帕利治療有效降低了腫瘤生長(圖7L-7M)，但也產生了強烈的促結締組織增生反應，其特征是膠原和HA沉積增強以及αSMA增加(圖7N)。在內源性TRAMP小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了類似的奧拉帕利誘導的促結締組織增生性應答(圖7O和7P)。為了檢驗這些發(fā)現(xiàn)與人類的相關性，將分析擴展到兩個人類PCa異種移植物(VCAP和H660)和之前報告的對奧拉帕利治療有應答的PDX模型。與小鼠數(shù)據(jù)一致，奧拉帕利在所有人類PCa模型中均誘導了強基質激活(圖S6F)。

圖7 奧拉帕尼治療模擬p62的乳酸損失，促進基質激活

總結

腫瘤細胞分泌的乳酸在轉錄水平下調p62，從而誘導基質激活。乳酸導致NAD+/NADH比值降低，從而損害poly(ADP-ribose)polymerase 1 (PARP-1)活性。臨床上使用的PARP-1抑制劑(如奧拉帕利)在下調p62和促進CAF活性方面模擬了乳酸的作用，這一事實揭示了基于PARP-1抑制劑的療法的一個出乎意料的潛在弱點，并提示奧拉帕利與抗基質靶向療法的聯(lián)合治療將提高奧拉帕利的療效。