短平快，10分文章的套路：僅3對(duì)細(xì)胞外泌體測(cè)序+30例血清外泌體PCR
盡管在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤(HGA)的組織病理學(xué)診斷方面取得了重大進(jìn)展，但有效的非侵入性診斷方法在很大程度上仍然未知。外泌體可以穿過(guò)血腦屏障，在人類(lèi)生物液體中很容易獲得，使它們成為HGA的有前途的生物標(biāo)志物。環(huán)狀RNA(circRNAs)由于其穩(wěn)定性、保守性和組織特異性，具有作為腫瘤生物標(biāo)志物的潛力。然而，外泌體circRNAs在HGA中的分布和特征仍有待研究。該研究于2022年2月發(fā)表在《Clinical Chemistry》，IF：12.167。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
1原代HGA細(xì)胞和配對(duì)外泌體的circRNA圖譜特征
CircRNAs是由癌細(xì)胞中的外泌體分泌到血液、尿液、母乳和唾液等體液中。血清外泌體取決于分泌細(xì)胞的來(lái)源。因此，從新病理診斷的HGA樣本(WHO分級(jí)IV)中培養(yǎng)3個(gè)原代腫瘤細(xì)胞(圖1A-C)。接下來(lái)檢查HGA樣本和原發(fā)腫瘤細(xì)胞的重要分子特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種HGA組織的分子模式相似，在所有3個(gè)原發(fā)腫瘤細(xì)胞中均出現(xiàn)異檸檬酸脫氫酶1突變，O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化雜合子模式缺失1p(圖1D-G)。從3個(gè)原代培養(yǎng)的HGA細(xì)胞(T01,T03和T05)及其配對(duì)的細(xì)胞衍生外泌體(T02,T04和T06)中使用特定的circRNA深度測(cè)序?qū)ircRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行了描述(圖1H-J)。
在原代HGA細(xì)胞和配對(duì)的細(xì)胞衍生外泌體中，總共發(fā)現(xiàn)了8117和2633個(gè)circRNA，與外泌體相比，HGA細(xì)胞中的circRNA濃度增加(每10億個(gè)mapping reads的剪接reads的平均值[SRPBM])(圖2A)。其次，與HGA細(xì)胞circRNA的基因組位置一致，觀察到HGA細(xì)胞衍生的外泌體circRNA主要來(lái)自外顯子區(qū)域(分別為87.53%和88.23%)，而其他circRNA則來(lái)自內(nèi)含子區(qū)域(分別為9%和8.5%)和基因間區(qū)域(分別為3.47%和3.27%)(圖2B)。26個(gè)高水平細(xì)胞circRNA產(chǎn)生宿主基因(上)和12個(gè)高水平外泌體circRNA產(chǎn)生宿主基因(下)的GO注釋如圖2C。HGA細(xì)胞circRNA(上)和HGA細(xì)胞衍生的外泌體circRNA(下)的染色體分布如圖2D。接著發(fā)現(xiàn)HGA細(xì)胞衍生的外泌體circRNA的濃度與HGA細(xì)胞circRNA的濃度只是適度相關(guān)(圖2E)。大多數(shù)外顯子circRNA長(zhǎng)度不超過(guò)1000 nt，而51.16%的內(nèi)含子circRNA和52.23%的基因間circRNA長(zhǎng)度超過(guò)3000 nt(圖2F)。
2 腫瘤細(xì)胞的高水平短外顯子circRNAs更容易在外泌體中富集
26個(gè)高表達(dá)的circRNAs共存于3個(gè)腫瘤細(xì)胞的circRNAs中，產(chǎn)生這26個(gè)富集的circRNAs的宿主基因具有獨(dú)特的分子功能和特征。真核生物同源組(KOG)分析顯示，最豐富的類(lèi)別是“general functional prediction only”，其次是“signal transduction mechanisms”(圖3A)。進(jìn)一步研究了12種circRNAs是否普遍富集于3個(gè)HGA細(xì)胞配對(duì)的外泌體中，宿主基因KOG分析顯示，最大的KOG群是“general functional prediction only”和“cytoskeleton”(圖3B)。有趣的是，幾乎所有高水平HGA細(xì)胞衍生的外泌體circRNAs都包含在HGA細(xì)胞circRNAs中(圖3C)。還發(fā)現(xiàn)這11個(gè)circRNAs起源于外顯子區(qū)域(11/11)。CircRNAs的長(zhǎng)度在200-1400 nt之間，63.63%的circRNAs長(zhǎng)度約為400 nt(圖3D)。圖3E表明高通量測(cè)序和qRT-PCR的結(jié)果基本一致。以上數(shù)據(jù)支持HGA細(xì)胞高表達(dá)和短外顯子的circRNAs更容易在外泌體中富集，并且這些circRNAs的含量在外泌體中極度富集。此外，在原代HGA細(xì)胞T03中未發(fā)現(xiàn)外泌體T04中的122個(gè)circRNAs，在原代HGA細(xì)胞T05中未發(fā)現(xiàn)外泌體T06中的79個(gè)circRNAs(圖3F)。作者推測(cè)外泌體中可能存在circRNA剪接/形成的機(jī)制，值得進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。
3 組織circRNAs在HGA預(yù)后監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用
發(fā)現(xiàn)2633個(gè)circRNAs被包裝在3個(gè)原代HGA腫瘤細(xì)胞源性外泌體中，然而無(wú)法確定circRNAs在HGA腫瘤組織和正常組織中是否存在差異。首先，在HGA細(xì)胞衍生的外泌體中隨機(jī)選擇32個(gè)circRNAs，檢測(cè)其在30例HGA患者和12例正常人中的表達(dá)(圖4A)。與正常組織相比，幾乎所有32種circRNAs在腫瘤組織中的表達(dá)濃度都較低。8個(gè)外顯子circRNAs在兩種組織類(lèi)型中的表達(dá)差異非常顯著(圖4B)。circRNAs hsa_circ_0005019、hsa_circ_0000880、hsa_circ_0051680和hsa_circ_0006365可以作為HGA的預(yù)后標(biāo)志物，這些circRNAs的高表達(dá)預(yù)示著HGA患者預(yù)后良好(圖4C)。
圖4 CircRNAs在HGA預(yù)后中作為組織活檢靶點(diǎn)
4、血清外泌體circRNAs在液體活檢中用于HGA的早期篩查
作者檢測(cè)了HGA患者和健康人的血清外泌體中32種選定的circRNAs的表達(dá)(圖5A)。3種circRNAs(上調(diào)的hsa_circ_0075828、下調(diào)的hsa_circ_0003828和下調(diào)的hsa_circ_0002976)在正常和HGA血清外泌體中的表達(dá)差異最大(圖5B)。計(jì)算了用于HGA檢測(cè)的這些circRNAs曲線下的面積。hsa_circ_0075828、hsa_circ_0002976和hsa_circ_0003828的曲線值下面積在0.8111到0.9861之間(圖5C)。這3種circRNAs可準(zhǔn)確區(qū)分HGA患者(30例)與健康個(gè)體(12例) (表1)?？傊?，circRNA hsa_circ_0075828、hsa_circ_0002976和hsa_circ_0003828的組合可以作為外泌體circRNA面板，用于HGA的敏感和精確篩選。
圖5 血清外泌體circRNAs在HGA診斷中作為液體活檢靶點(diǎn)
結(jié)論
這項(xiàng)研究揭示了HGA外泌體和細(xì)胞中全面的circRNAs景觀。血清外泌體circRNAs、外泌體circRNAs面板和組織circRNAs對(duì)HGA液體活檢和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有潛在的作用。外泌體circRNAs作為新的靶點(diǎn)，有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物，并有助于HGA的診斷和治療監(jiān)測(cè)。