EWSR1誘導(dǎo)的circNEIL3通過穩(wěn)定IGF2BP3促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展和外泌體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫抑制極化

膠質(zhì)瘤是最常見的惡性原發(fā)性腦腫瘤，具有高度免疫抑制腫瘤微環(huán)境(TME)，預(yù)后差。環(huán)狀RNAs (circRNA)是一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA，具有高穩(wěn)定性、豐度、保持性等特點(diǎn)，在多種腫瘤的病理生理過程和TME重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。circNEIL3可被EWS RNA結(jié)合蛋白1(EWSR1)環(huán)化，在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)，并與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展呈正相關(guān)。功能上，circNEIL3在體內(nèi)和體外促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和癌變進(jìn)程。機(jī)制上，circNEIL3通過阻止HECTD4介導(dǎo)的泛素化來穩(wěn)定IGF2BP3蛋白(一種已知的致癌蛋白)。circNEIL3過表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤微環(huán)境(TME)。circNEIL3被hnRNPA2B1包裝成外泌體，并傳遞給浸潤(rùn)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)，使它們通過穩(wěn)定IGF2BP3獲得免疫抑制特性，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。本文揭示了circNEIL3在促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)生、惡性進(jìn)展和巨噬細(xì)胞腫瘤促進(jìn)表型極化方面發(fā)揮著顯著作用，突出了circNEIL3是膠質(zhì)瘤潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文于2022年1月發(fā)表于Molecular Cancer (IF=41.444)上。

技術(shù)路線:

主要研究結(jié)果：

(1) circNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中顯著上調(diào)

為了鑒定參與膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的潛在致癌circRNAs，我們利用RNA測(cè)序(RNA-seq)分析了39個(gè)膠質(zhì)瘤組織和8個(gè)正常腦組織(NBTs)中circRNAs的表達(dá)譜?；鹕綀D顯示，在GBM和LGG之間以及LGG和NBTs之間，circRNA表達(dá)存在系統(tǒng)性差異(圖1A,B)。我們進(jìn)一步分析了膠質(zhì)瘤組織中差異上調(diào)的circRNAs，并鑒定出hsa_circ_0001460，這是唯一一種隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)升高而上調(diào)的circRNAs(圖1C)。將hsa_circ_0001460命名為circNEIL3，它是從NEIL3生成的。與NBTs相比，circNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中明顯上調(diào)且其表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高而升高(圖1D)。采用ROC曲線評(píng)估circNEIL3對(duì)膠質(zhì)瘤分級(jí)的診斷效果，曲線下面積AUC為0.719，表明circNEIL3可以預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良(圖1E)。

circNEIL3后剪接在NEIL3基因的第8外顯子和第9外顯子之間，長(zhǎng)度為596 nt(圖1F)。使用發(fā)散引物擴(kuò)增circNEIL3的后剪接結(jié)位點(diǎn)，并通過Sanger測(cè)序確認(rèn)(圖1F)。我們?cè)O(shè)計(jì)了發(fā)散型和收斂型引物來擴(kuò)增circNEIL3及其線性形式。RT-qPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示，circNEIL3只能從cDNA中擴(kuò)增，而其線性形式可以從cDNA和gDNA中擴(kuò)增(圖1G)。我們通過RNase R和放線菌素D的處理，證實(shí)circNEIL3比NEIL3更穩(wěn)定(圖1H,I)。circRNAs的功能主要與其在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)。然后我們進(jìn)行了核細(xì)胞質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)和FISH分析。circNEIL3主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1J,K)。這些結(jié)果表明，circNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中顯著上調(diào)，且在GBM中表達(dá)量最高，提示其參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展。

圖1：circRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)譜及circNEIL3的鑒定

(2)circNEIL3在體外和體內(nèi)均促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生

為了研究circNEIL3在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的潛在生物學(xué)作用，我們根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)與circNEIL3表達(dá)顯著正相關(guān)的基因進(jìn)行KEGG富集分析。為了探索這些不同circNEIL3表達(dá)樣本之間的生物學(xué)行為，我們使用單樣本GSEA (ssGSEA)算法來估計(jì)每個(gè)樣本的通路富集分?jǐn)?shù)。

由于circNEIL3可能參與細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，我們進(jìn)一步研究了circNEIL3在細(xì)胞行為中的功能。我們證實(shí)下調(diào)circNEIL3顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。過表達(dá)circNEIL3在體外顯著促進(jìn)了這些細(xì)胞行為(圖2A-D)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)circNEIL3可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和侵襲性，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期，而過表達(dá)circNEIL3則具有相反的作用(圖2E,F)。切除的腫瘤切片免疫組化(IHC)顯示，circNEIL3敲除的腫瘤組織中Ki67(一種增殖標(biāo)志物)和CD44(一種侵襲標(biāo)志物)的表達(dá)低于載體組，而circNEIL3過表達(dá)則相反(圖2G)。這些數(shù)據(jù)表明circNEIL3在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和膠質(zhì)瘤進(jìn)展中具有重要的功能。

圖2：circNEIL3在體內(nèi)外促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

(3)EWSR1在膠質(zhì)瘤中促進(jìn)circNEIL3的生物發(fā)生

circRNAs的環(huán)化機(jī)制是由RNA結(jié)合蛋白(RBPs)結(jié)合到pre-mRNA的上游和下游區(qū)域來調(diào)控的。我們利用CircInteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了EWSR1在circNEIL3的上游和下游區(qū)域的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，分別為序列1、序列2和序列3(圖3A)。EWSR1的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤的分級(jí)而升高，高表達(dá)的患者預(yù)后比低表達(dá)的患者差(圖3B)。我們驗(yàn)證了敲除EWSR1可以抑制GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移(圖3C,D)。在我們自己的數(shù)據(jù)庫中，circNEIL3與EWSR1正相關(guān)(圖3E)，并且在EWSR下調(diào)的U251和A172細(xì)胞中circNEIL3的表達(dá)明顯死亡(圖3F)。最近的一項(xiàng)研究表明，EWSR1在缺氧環(huán)境中可能更活躍。因此，我們將U251和A172細(xì)胞置于缺氧條件下0 h、6 h、12 h和24 h, EWSR1和circNEIL3的表達(dá)隨著暴露時(shí)間的增加而上調(diào)(圖3G,H)。RIP-qPCR檢測(cè)證實(shí)EWSR1可與NEIL3 pre-mRNA序列1和序列3結(jié)合，且在缺氧條件下結(jié)合能力明顯上調(diào)(圖3I)。為了進(jìn)一步證實(shí)觀察到的EWSR1介導(dǎo)的表型是由circNEIL3表達(dá)失調(diào)促進(jìn)的，我們進(jìn)行了功能挽救實(shí)驗(yàn)。如圖3J-L所示，EWSR1過表達(dá)可引起U251和A172細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的增加，而下調(diào)circNEIL3可逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。這些數(shù)據(jù)表明，circNEIL3可以被EWSR1環(huán)化，并且這個(gè)過程在缺氧條件下更活躍。

圖3：EWSR1促進(jìn)circNEIL3的生物發(fā)生

(4)circNEIL3與IGF2BP3物理相互作用，抑制泛素/蛋白酶體介導(dǎo)的IGF2BP3降解

為了探索circNEIL3誘導(dǎo)GBM細(xì)胞進(jìn)展的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了RNA下拉實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)探索與circNEIL3結(jié)合的潛在蛋白質(zhì)。circNEIL3與IGF2BP3蛋白結(jié)合(圖4A)。RNA下拉和RIP-qPCR證實(shí)了circNEIL3與IGF2BP3之間的相互作用(圖4B,C)。RNA FISH-免疫熒光(FISH-IF)分析表明circNEIL3與IGF2BP3在細(xì)胞質(zhì)中共定位(圖4D)。我們建立了6個(gè)FLAG標(biāo)記載體，并通過Western Blot檢測(cè)哪些結(jié)構(gòu)域與circNEIL3相互作用(圖4E,F)。RIP-qPCR顯示，circNEIL3主要結(jié)合在KH3-4區(qū)域，這表明KH3-4雙結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)招募circNEIL3(圖4G)。然后我們?cè)?/span>circNEIL3中尋找IGF2BP3募集所必需的基序。我們?cè)O(shè)計(jì)了三個(gè)突變位點(diǎn)，IGF2BP3與circNEIL3的第三個(gè)位點(diǎn)結(jié)合(圖4H)。這些結(jié)果表明circNEIL3在細(xì)胞質(zhì)中與IGF2BP3發(fā)生物理相互作用。

circNEIL3沒有顯著改變IGF2BP3的mRNA水平(圖4I)，但顯著促進(jìn)了其蛋白表達(dá)及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)，包括CDK4/6、CD44和c-MYC(圖4J)，這些靶點(diǎn)參與細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的生物學(xué)功能。circNEIL3過表達(dá)增強(qiáng)了IGF2BP3蛋白的表達(dá)水平，延長(zhǎng)了IGF2BP3的半衰期(圖4K)。circNEIL3過表達(dá)降低了IGF2BP3的泛素化(圖4L)。我們僅鑒定出一個(gè)位于IGF2BP3的KH3結(jié)構(gòu)域的泛素化賴氨酸(K)殘基(K450)(圖4N)。使用uniport數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)IGF2BP3的K450位點(diǎn)在6個(gè)物種中高度保守(圖4N)。我們預(yù)測(cè)了IGF2BP3的結(jié)構(gòu)，并可視化K450泛素化位點(diǎn)(圖4O)。免疫共淀(IP)顯示，與WT IGF2BP3相比，K450突變顯著降低了IGF2BP3的泛素化水平，并且在表達(dá)該突變體的細(xì)胞中，circNEIL3過表達(dá)導(dǎo)致的泛素化增強(qiáng)也被抑制(圖4M)，表明K450是IGF2BP3的主要泛素化位點(diǎn)。因此circNEIL3通過抑制泛素/蛋白酶體依賴性降解，增強(qiáng)了IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。

圖4：circNEIL3與IGF2BP3發(fā)生物理相互作用并抑制其泛素化

(5)circNEIL3通過阻止HECTD4介導(dǎo)的泛素化來穩(wěn)定IGF2BP3蛋白

TRIM25在NSCLC中介導(dǎo)IGF2BPs的泛素化。然而目前尚無E3泛素連接酶介導(dǎo)膠質(zhì)瘤IGF2BP3泛素化的報(bào)道。因此，我們?cè)噲D鑒定E3連接酶參與膠質(zhì)瘤中蛋白酶體介導(dǎo)的IGF2BP3降解。我們?cè)隗w外驗(yàn)證了HECTD4可以抑制GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移(圖5A,B)。我們進(jìn)行了免疫熒光(IF)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)IGF2BP3與HECTD4在細(xì)胞質(zhì)中共定位(圖5C)。在HECTD4敲低的GBM細(xì)胞中，IGF2BP3蛋白水平顯著升高(圖5D)，而其泛素化水平明顯降低(圖5E)，這表明在膠質(zhì)瘤中，HECTD4作為E3泛素連接酶，通過泛素-蛋白酶體途徑降解IGF2BP3。

對(duì)circNEIL3的質(zhì)譜分析顯示，circNEIL3沒有與HECTD4結(jié)合，但過表達(dá)的circNEIL3可以阻斷IGF2BP3與HECTD4的結(jié)合(圖5F)，這解釋了circNEIL3如何穩(wěn)定IGF2BP3。為了進(jìn)一步證實(shí)circNEIL3可以抑制IGF2BP3與赫克特4的結(jié)合，我們進(jìn)行了Co-IP實(shí)驗(yàn)，HECTD4與IGF2BP3的KH3-4結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這是circNEIL3與IGF2BP3相互作用的同一位點(diǎn)(圖5G, 4G)。這些數(shù)據(jù)表明circNEIL3通過空間位阻阻斷了IGF2BP3與HECTD4的結(jié)合，最終抑制了IGF2BP3的泛素化?？傊?/span>circNEIL3通過阻止HECTD4介導(dǎo)的泛素化來穩(wěn)定IGF2BP3蛋白。

圖5：circNEIL3阻斷了IGF2BP3和HECTD4的結(jié)合

(6)circNEIL3促進(jìn)膠質(zhì)瘤巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)

為了探討circNEIL3表達(dá)不同的膠質(zhì)瘤樣本之間生物學(xué)行為的差異，我們根據(jù)circNEIL3的中位表達(dá)將膠質(zhì)瘤樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。采用Deseq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析，高表達(dá)組與circNEIL3低表達(dá)組共有801個(gè)基因存在差異表達(dá)；531個(gè)基因上調(diào)，270個(gè)基因下調(diào)。

為進(jìn)一步了解circNEIL3在膠質(zhì)瘤免疫表型中的確切作用，使用ESTIMATE算法評(píng)估了膠質(zhì)瘤純度、基質(zhì)和免疫評(píng)分。如圖6A所示，circNEIL3高表達(dá)組較circNEIL3低表達(dá)組細(xì)胞浸潤(rùn)TME較多，免疫和間質(zhì)評(píng)分較高，腫瘤純度較低。與低circNEIL3表達(dá)的膠質(zhì)瘤相比，高circNEIL3表達(dá)的膠質(zhì)瘤巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，巨噬細(xì)胞構(gòu)成了膠質(zhì)瘤TME中最豐富的細(xì)胞群。circNEIL3高表達(dá)膠質(zhì)瘤中TAM BMDM(以下簡(jiǎn)稱巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn)明顯增加，TAM MGs數(shù)量有所減少(圖6A)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與NC組相比，來自circNEIL3過表達(dá)的GBM細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)顯著促進(jìn)了THP1分化的巨噬細(xì)胞遷移(圖6B)，而來自circNEIL3低表達(dá)的GBM細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)顯示相反的結(jié)果(圖6C)。circNEIL3過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞可以驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到膠質(zhì)瘤微環(huán)境中。

接下來，我們探討了circNEIl3促進(jìn)巨噬細(xì)胞募集的潛在調(diào)控機(jī)制。GSEA結(jié)果表明，與circNEIL3-low樣本相比，高circNEIL3樣本中YAP1信號(hào)信號(hào)基因簽名高度富集(圖6D)。對(duì)TCGA膠質(zhì)瘤樣本中IGF2BP3的評(píng)估也顯示了相同的結(jié)果(圖6E)。qRT-PCR驗(yàn)證了circNEIL3促進(jìn)CCL2和LOX表達(dá)的結(jié)果(圖6F)，而這種由circNEIL3過表達(dá)引起的表達(dá)增強(qiáng)可以通過下調(diào)IGF2BP3來挽救(圖6G)。circNEIL3可以增加GBM細(xì)胞中YAP1和LOX的蛋白表達(dá)(圖6H)。circNEIL3過表達(dá)引起的表達(dá)增加也可以通過敲低IGF2BP3來消除(圖6I)。總之，circNEIL3過表達(dá)的GBM細(xì)胞可能通過激活YAP1信號(hào)通路來驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤相關(guān)微環(huán)境中。

圖6：circNEIL3在膠質(zhì)瘤中促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)

(7) circNEIL3可以被hnRNPA2B1包裝成外泌體

circRNAs可以被包裝成外泌體，并在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。在中性鞘磷脂酶-2 (nSMase)藥理抑制劑GW4869處理的細(xì)胞中，circNEIL3的表達(dá)下調(diào)，阻斷了外泌體的形成(補(bǔ)充圖未展示)，從而證實(shí)了circNEIL3在外泌體中存在。這些結(jié)果表明circNEIL3可以被包裝到外泌體中。

接下來，我們研究了circNEIL3被包裝到外泌體中的機(jī)制。我們?cè)?/span>GBM細(xì)胞中通過RIP和RNA下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circNEIL3和hnRNPA2B1之間的相互作用(圖7A,B)。在hnRNPA2B1敲除的GBM細(xì)胞中，circNEIL3在細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在外泌體中表達(dá)下調(diào)(圖7C)。這些結(jié)果表明circNEIL3可以被hnRNPA2B1包裝成外泌體。

圖7：外泌體可以將circNEIL3傳遞給TAMs，從而使它們獲得血管生成和免疫抑制特性

(8)外泌體將circNEIL3傳遞給TAMs，從而使它們通過穩(wěn)定IGF2BP3獲得免疫抑制特性

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示circNEIL3過表達(dá)顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志物CD163(圖7D)。circNEIL3過表達(dá)顯著上調(diào)了維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活并刺激血管生成的SPP1蛋白表達(dá)。我們假設(shè)外泌體可以將circNEIL3傳遞到巨噬細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫抑制表型。隨著circNEIL3在外泌體中的表達(dá)增加，巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志物、免疫抑制分子和SPP1顯著上調(diào)(圖7E,F)。這些結(jié)果表明，外泌體可以將circNEIL3傳遞給TAMs，從而使它們獲得血管生成和免疫抑制特性。

為了闡明circNEIL3介導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫抑制特性的機(jī)制，進(jìn)行了RNA下拉和RIP實(shí)驗(yàn)，在THP1分化的巨噬細(xì)胞中，circNEIL3與IGF2BP3結(jié)合的位置與腫瘤細(xì)胞中相同(圖7G,H)。在腫瘤細(xì)胞中，circNEIL3增加了分化的THP1巨噬細(xì)胞中IGF2BP3蛋白的表達(dá)并抑制了IGF2BP3的泛素化(圖7I,J)。Western Blot證實(shí)，在THP1分化的巨噬細(xì)胞中，過表達(dá)circNEIL3和IGF2BP3均能增強(qiáng)YAP1蛋白的表達(dá)，而敲除它們則相反(圖7K,L)。過表達(dá)circNEIL3所引起的YAP1蛋白表達(dá)增強(qiáng)可被敲除IGFB2P3所消除(圖7M)，提示circNEIL3通過穩(wěn)定IGF2BP3蛋白來增強(qiáng)YAP1的表達(dá)。這反過來促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的免疫抑制表型極化。

為進(jìn)一步驗(yàn)證circNEIL3在體內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化的作用，將過表達(dá)cicrNEIL3的巨噬細(xì)胞或陰性對(duì)照載體與膠質(zhì)瘤細(xì)胞原位共植入裸鼠大腦。與NC組相比，circNEIL3過表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)升高，荷瘤小鼠生存期延長(zhǎng)(圖7N-P)。IGF2BP3可以作為circNEIL3在巨噬細(xì)胞中的下游效應(yīng)子，使其獲得免疫抑制特性，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。

結(jié)論：

一種新的環(huán)狀RNAcircNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)。circNEIL3的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤分級(jí)的增加而增加，而circNEIL3可受EWSR1的調(diào)控。功能上，circNEIL3在體外和體內(nèi)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展。機(jī)制上，circNEIL3通過阻止HECTD4介導(dǎo)的泛素化來穩(wěn)定IGF2BP3。過表達(dá)circNEIL3的膠質(zhì)瘤細(xì)胞可促使巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)TME。circNEIL3可以被hnRNPA2B1包裝成外泌體并傳遞給浸潤(rùn)的TAMs，從而使它們通過穩(wěn)定IGF2BP3獲得免疫抑制特性，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展。circNEIL3是一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物和有前途的膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)。

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