FSTL1通過調(diào)節(jié)PKM2的細(xì)胞內(nèi)功能，使巨噬細(xì)胞功能重新編程，從而促進(jìn)肝纖維化

卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)是一種分泌糖蛋白，但其在肝纖維化巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥調(diào)節(jié)中的作用尚未被證實(shí)。我們旨在描述巨噬細(xì)胞FSTL1在肝纖維化中的作用。構(gòu)建髓系特異性FSTL1-敲除(FSTL1^M-KO)小鼠，探討巨噬細(xì)胞FSTL1在注射四氯化碳、膽管結(jié)扎或缺甲硫氨酸和缺膽堿飲食誘導(dǎo)的3種小鼠肝纖維化模型中的功能和機(jī)制。FSTL1在人和小鼠纖維化肝臟巨噬細(xì)胞中的表達(dá)均顯著升高。髓系特異性FSTL1缺失可有效減緩肝纖維化的進(jìn)展。在FSTL1^M-KO小鼠中，在肝纖維化過程中形成的微環(huán)境表現(xiàn)出相對(duì)較少的炎癥，這可通過單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減弱以及促炎因子表達(dá)減少來(lái)證明。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，FSTL1^M-KO巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出抑制的促炎M1極化和核因子κB通路激活。通過其FK結(jié)構(gòu)域，FSTL1直接結(jié)合到丙酮酸激酶M2 (PKM2)。FSTL1促進(jìn)PKM2磷酸化和核易位，減少PKM2泛素化以增強(qiáng)PKM2依賴的糖酵解，并增加M1極化。PKM2的藥理激活(DASA-58)部分對(duì)抗FSTL1介導(dǎo)的糖酵解和炎癥。巨噬細(xì)胞FSTL1通過誘導(dǎo)M1極化和炎癥促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展，其機(jī)制是基于巨噬細(xì)胞胞內(nèi)PKM2重編程功能。本文于2022年12月發(fā)表于Gut(IF=31.793)上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

(1) 纖維化肝組織巨噬細(xì)胞中FSTL1表達(dá)增加

為確定FSTL1在纖維化肝臟樣本中的表達(dá)，我們收集了51份人類肝臟樣本，包括正常和纖維化肝組織。與正常對(duì)照肝臟相比，纖維化肝臟中FSTL1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(圖1A,B)。接下來(lái)，我們確定FSTL1的表達(dá)是否主要在肝臟巨噬細(xì)胞中升高。雙免疫熒光染色顯示FSTL1主要表達(dá)于人纖維化肝臟的巨噬細(xì)胞上(圖1C)。通過重新分析已發(fā)表的數(shù)據(jù)集，我們發(fā)現(xiàn)FSTL1表達(dá)在HCV誘導(dǎo)或NASH誘導(dǎo)的肝纖維化中顯著升高(圖1D)。

我們探索了FSTL1在三種被廣泛認(rèn)可的肝纖維化動(dòng)物模型中的表達(dá)，即CCl₄注射誘導(dǎo)、BDL誘導(dǎo)和MCD飲食誘導(dǎo)的肝纖維化。所有模型的肝組織中FSTL1的表達(dá)均顯著增加(圖1E,F)。然后，我們從小鼠纖維化肝臟中分離肝臟巨噬細(xì)胞。從纖維化肝臟分離的巨噬細(xì)胞中，FSTL1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(圖1G)。雙免疫熒光染色進(jìn)一步顯示，纖維化肝臟中FSTL1⁺CD68⁺巨噬細(xì)胞明顯多于對(duì)照肝臟(圖1H)。在肝纖維化組織中，FSTL1在巨噬細(xì)胞上高表達(dá)，在HSCs上低表達(dá)，在肝細(xì)胞上不表達(dá)(補(bǔ)充圖未展示)。綜上所述，FSTL1在肝組織，尤其是纖維化肝臟巨噬細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。

圖1：肝纖維化組織巨噬細(xì)胞卵泡抑素樣蛋白1 (FSTL1)表達(dá)增加

(2) 髓系FSTL1缺失可緩解肝纖維化

為了檢測(cè)FSTL1⁺巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的作用，我們使用Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建了髓系特異性FSTL1-缺陷(FSTL1^M-KO)小鼠。然后，用CCl₄注射、BDL或MCD飲食誘導(dǎo)FSTL1^FL/FL和FSTL1^M-KO小鼠肝纖維化。圖2A顯示，與FSTL1^FL/FL小鼠相比，FSTL1^M-KO小鼠的肝纖維化明顯較低，如Masson’s、Sirius Red和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)染色所示。此外，攻毒后FSTL1^M-KO小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平降低(圖2B)。此外，FSTL^M-KO小鼠肝組織中TGF-β、TIMP-1和I型膠原蛋白的表達(dá)明顯低于同窩對(duì)照組(圖2C)。Western blot (WB)分析進(jìn)一步顯示，與對(duì)照組相比，FSTL1缺失降低了纖維化肝組織中I型膠原、α-SMA和TIMP-1的表達(dá)(圖2D)。我們的研究結(jié)果表明，骨髓性FSTL1缺失可以減弱小鼠的肝纖維化。

圖2：骨髓卵泡抑素樣蛋白1 (FSTL1)缺乏可減輕小鼠肝纖維化

(3) 髓系FSTL1缺失可減弱纖維化肝臟中的炎癥和巨噬細(xì)胞/中性粒細(xì)胞募集

我們研究了FSTL1⁺巨噬細(xì)胞對(duì)纖維化肝組織局部炎癥的影響。圖3A顯示，FSTL1^M-KO小鼠的纖維化肝臟中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的表達(dá)低于對(duì)照組，IL-10的表達(dá)高于對(duì)照組。與同窩小鼠相比，FSTL1^M-KO小鼠的血清TNF-α和IL-1β水平始終較低，而IL-10水平較高(圖3B)。我們通過在纖維化肝組織中染色F4/80和CD11b(巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)和Ly6G(中性粒細(xì)胞標(biāo)記物)來(lái)評(píng)估肝臟炎癥細(xì)胞的積累。與FSTL1^FL/FL小鼠相比，骨髓特異性FSTL1缺失顯著減少了纖維化肝組織中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖3C-E)。

圖3：骨髓卵泡抑素樣蛋白1 (FSTL1)缺乏可減輕小鼠纖維化肝臟的炎癥

(4) 骨髓性FSTL1缺陷抑制纖維化肝臟中M1極化和NF-κB通路激活

髓系特異性FSTL1缺失可緩解肝臟炎癥，這表明FSTL1可能促進(jìn)M1極化。我們分析了肝臟切片中M1巨噬細(xì)胞的定量。與FSTL1^FL/FL小鼠相比，FSTL1^M-KO小鼠中iNOS⁺CD68⁺巨噬細(xì)胞更少(圖4A)。在FSTL1^M-KO小鼠的纖維化肝臟中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表達(dá)下調(diào)，而Arg1表達(dá)上調(diào)(圖4B)。WB分析顯示，與對(duì)照組相比，骨髓性FSTL1缺陷小鼠纖維化肝臟中iNOS和p-STAT1表達(dá)降低，p-STAT6表達(dá)增加(圖4C)。TLR-4/NF-κB通路是巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的急性/慢性肝炎癥的重要調(diào)控通路。對(duì)纖維化肝臟的免疫染色和WB分析也顯示，FSTL1^M-KO小鼠TLR-4/NF-κB通路激活降低(圖4D,E)。

圖4：髓系卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)缺乏抑制小鼠纖維化肝臟M1極化和核因子κB (NF-κB)通路激活

(5) FSTL1直接與PKM2結(jié)合，增強(qiáng)PKM2在巨噬細(xì)胞中的穩(wěn)定性

為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞FSTL1在肝纖維化過程中的調(diào)控機(jī)制，采用免疫沉淀(IP)和LC-MS/MS篩選方法探討FSTL1與巨噬細(xì)胞中潛在蛋白的結(jié)合。我們要確定PKM2在巨噬細(xì)胞中是否直接與FSTL1相互作用(圖5A,B)。FSTL1在巨噬細(xì)胞中與PKM2結(jié)合(圖5C)。共聚焦免疫熒光分析顯示，FSTL1與PKM2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中共定位(圖5D)。構(gòu)建編碼4個(gè)帶有血凝素(HA)標(biāo)記的FSTL1截?cái)嗥魏?/span>3個(gè)帶有FLAG標(biāo)記的PKM2截?cái)嗥蔚馁|(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293個(gè)T細(xì)胞(圖5E)。FSTL1的FK結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂cPKM2的N-端或C-端相互作用至關(guān)重要(圖5F)。這些結(jié)果表明，FSTL1通過FSTL1的FK結(jié)構(gòu)域和PKM2的N-端或C-端直接與PKM2相互作用。環(huán)己亞胺chase實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在FSTL1下調(diào)的細(xì)胞中，PKM2的半衰期較短，而在FSTL1過表達(dá)的細(xì)胞中，PKM2的半衰期比對(duì)照細(xì)胞長(zhǎng)得多(圖5G)。這些結(jié)果表明FSTL1可能通過抑制蛋白酶體降解來(lái)調(diào)節(jié)PKM2的穩(wěn)定性。通過向FSTL1^M-KO和FSTL1^o/e骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMDMs)培養(yǎng)中添加MG-132，PKM2蛋白水平的降低伴隨FSTL1的下調(diào)得以恢復(fù)(圖5H)。FSTL1的下調(diào)增加了FSTL1^M-KO BMDMs中PKM2蛋白的泛素化水平。泛素介導(dǎo)的PKM2降解作用在過表達(dá)FSTL1的BMDMs中被顯著取消(圖5I)。PKM2泛素化是PKM2磷酸化和核易位的關(guān)鍵步驟。

圖5：卵泡抑素樣蛋白1 (FSTL1)直接與丙酮酸激酶M2 (PKM2)結(jié)合，增強(qiáng)PKM2在巨噬細(xì)胞中的穩(wěn)定性

(6) FSTL1促進(jìn)PKM2磷酸化和纖維化肝組織巨噬細(xì)胞的核易位

為了探討PKM2在FSTL1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎表型轉(zhuǎn)換中的作用，我們研究了PKM2在纖維化肝臟巨噬細(xì)胞中的表達(dá)是否發(fā)生改變。免疫熒光染色顯示，與對(duì)照組相比，纖維化肝臟有更多的FSTL1⁺巨噬細(xì)胞(圖6A，上面板)和PKM2⁺巨噬細(xì)胞(圖6A，下面板)。PKM2和FSTL1在纖維化肝組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)均明顯增加(圖6B)。免疫熒光染色顯示，與對(duì)照組肝臟相比，患者肝臟巨噬細(xì)胞中PKM2和FSTL1的核易位明顯增加(圖6A，紫色區(qū)域)。相反，與FSTL1^FL/FL小鼠相比，髓系FSTL1的破壞明顯減少了PKM2⁺巨噬細(xì)胞，并阻礙了PKM2在肝臟巨噬細(xì)胞中的核輸入(圖6C)。我們分析了分離的肝巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中總PKM2和p-PKM2以及細(xì)胞核中總PKM2的蛋白表達(dá)情況。圖6D顯示，與FSTL1^FL/FL對(duì)照相比，FSTL1缺失降低了細(xì)胞質(zhì)中總PKM2和p-PKM2的表達(dá)，進(jìn)而降低了細(xì)胞核中總PKM2的表達(dá)。綜上所述，巨噬細(xì)胞FSTL1促進(jìn)PKM2的核轉(zhuǎn)位。

圖6：卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)促進(jìn)纖維化肝組織巨噬細(xì)胞的丙酮酸激酶M2 (PKM2)磷酸化和核易位

(7) FSTL1缺失減弱巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、M1極化和糖酵解

為了進(jìn)一步分析FSTL1在體外如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，從FSTL1^FL/FL或FSTL1^M-KO小鼠細(xì)胞中分化出BMDMs，并對(duì)其進(jìn)行脂多糖(LPS)刺激。FSTL1^M-KO巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-1β表達(dá)降低，IL-10表達(dá)升高(圖7A,B)。FSTL1缺失減弱了M1極化，并降低了LPS處理后BMDMs中的TLR-4/NF-κB通路激活(圖7C-G)。FSTL1^M-KOBMDMs中PKM2表達(dá)及其核易位減弱(圖7C,D)。為了探索FSTL1是否也調(diào)節(jié)糖酵解，我們檢測(cè)了這些巨噬細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率(ECAR)和相對(duì)乳酸釋放水平。與FSTL1^FL/FL BMDMs相比，LPS刺激后FSTL1^M-KO BMDMs的ECAR和乳酸顯著降低(圖7H,I)。使用糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)阻斷葡萄糖供應(yīng)，FSTL1^M-KO BMDMs中IL-1β和iNOS表達(dá)的下降被抑制(圖7J)。在LPS誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境中與BMDMs共培養(yǎng)HSCs。缺乏FSTL1的BMDMs顯著降低α-SMA的表達(dá)，并減弱了造血干細(xì)胞的激活(補(bǔ)充圖未展示)。

圖7：卵泡抑素樣蛋白1 (FSTL1)缺乏減弱巨噬細(xì)胞的炎癥和糖酵解

(8) PKM2激活劑抑制巨噬細(xì)胞中FSTL1介導(dǎo)的M1極化和糖酵解

為了進(jìn)一步確定PKM2對(duì)FSTL1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化和糖酵解的影響，用小分子PKM2激活劑DASA-58。處理FSTL1過表達(dá)(FSTL1^o/e)的BMDMs, DASA-58減輕FSTL1^o/e誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β，同時(shí)增加IL-10水平(圖8A,B)。PKM2、iNOS和p65的免疫熒光染色表明，抑制PKM2核轉(zhuǎn)位逆轉(zhuǎn)了FSTL1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化和NF-κB激活(圖8C,D)。這些結(jié)果通過BMDMs中PKM2、p-PKM2、iNOS、p-STAT1、p-STAT6、TLR-4、p-Ikk和p-p65表達(dá)的WB分析得到證實(shí)(圖8E-G)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PKM2在FSTL1介導(dǎo)的糖酵解中的作用，我們檢測(cè)了ECAR和相對(duì)乳酸釋放水平。與FSTL1^n/e BMDMs相比，FSTL1^o/e BMDMs中的ECAR和乳酸顯著升高，DASA-58有效逆轉(zhuǎn)了FSTL1^o/e誘導(dǎo)的糖酵解增加(圖8H,I)。FSTL1^o/e相關(guān)的促炎介質(zhì)(IL-1β和iNOS)被2-DG中和(圖8J)。這些結(jié)果證實(shí)PKM2的核和細(xì)胞質(zhì)功能對(duì)FSTL1誘導(dǎo)的M1極化、糖酵解和炎癥至關(guān)重要。

圖8：丙酮酸激酶M2 (PKM2)激活劑抑制巨噬細(xì)胞中卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)介導(dǎo)的炎癥和糖酵解

結(jié)論：

綜上所述，我們揭示了巨噬細(xì)胞FSTL1在肝纖維化中的作用。FSTL1通過與PKM2結(jié)合，促進(jìn)PKM2磷酸化和抑制PKM2泛素化在巨噬細(xì)胞中促進(jìn)M1極化、糖酵解和炎癥反應(yīng)。通過識(shí)別FSTL1介導(dǎo)肝臟炎癥的分子途徑，我們的發(fā)現(xiàn)為改善巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化的新治療方法提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

Rao, J., Wang, H., Ni, M., Wang, Z., Wang, Z., Wei, S., Liu, M., Wang, P., Qiu, J., Zhang, L., Wu, C., Shen, H., Wang, X., Cheng, F., & Lu, L. (2022). FSTL1 promotes liver fibrosis by reprogramming macrophage function through modulating the intracellular function of PKM2. Gut, 71(12), 2539–2550. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325150.