PP4抑制通過(guò)STAT1激活和炎癥信號(hào)增強(qiáng)卵巢癌對(duì)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的敏感性
T細(xì)胞在卵巢腫瘤中的浸潤(rùn)增加已被反復(fù)證明可以預(yù)測(cè)患者生存率的提高。然而，盡管有證據(jù)表明卵巢癌（ovarian cancer，OC）中存在主動(dòng)免疫反應(yīng)，但OC對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療的反應(yīng)頻率遠(yuǎn)低于其他癌癥類型。最近的研究強(qiáng)調(diào)，DNA損傷反應(yīng)（DDR）的缺陷會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和腫瘤免疫原性的增加，從而導(dǎo)致對(duì)ICB的反應(yīng)增強(qiáng)。蛋白磷酸酶4（PP4）是DDR的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，其在抗腫瘤免疫中的潛在作用目前尚不清楚。本研究明確抑制PP4在促進(jìn)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)和增強(qiáng)免疫
細(xì)胞效應(yīng)功能中的作用。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究PP4抑制劑增強(qiáng)OC的化學(xué)免疫治療提供了支持。本研究于2022年12月發(fā)表于期刊《J Immunother Cancer》上，IF：12.469。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
為更好的研究理解PP4在敖正中的作用，作者利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)研究PPP4C, PPP4R3A, PPP4R3B, PPP4R2亞基的基因組水平變化，發(fā)現(xiàn)PP4亞基基因在大約6%的OC腫瘤中主要擴(kuò)增（圖1A）。類似于OC，浸潤(rùn)性乳腺癌，膀胱尿路上皮癌和景園細(xì)胞劉也顯示PP4亞單位基因顯著擴(kuò)增（圖1A）。此外，還觀察到信使之間有顯著的一致性和泛癌TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PPP4C的RNA水平（圖1B）。為評(píng)估在OC中靶向PP4復(fù)合物的效用，作者接下來(lái)評(píng)估OC TCGA數(shù)據(jù)集中PP4亞基的表達(dá)水平。利用RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與正常卵巢和輸卵管組織相比，PPP4C在OC中顯著過(guò)表達(dá)（圖1C），而調(diào)節(jié)亞基的表達(dá)水平是可變的。PPP4R3B和PPP4R2 mRNA表達(dá)增加。相比之下，PPP4R3A在正常組織中含量更高（圖1C）。在蛋白質(zhì)水平上，PP4C被發(fā)現(xiàn)在代表性的高級(jí)別漿液性卵巢癌(HGSOC)細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)（圖1D）。作者注意到PPP4R3β調(diào)節(jié)亞基在OC細(xì)胞系中的表達(dá)變化，其中HTYK-nu和59M的表達(dá)變化最?。▓D1D）。類似的結(jié)論在PPP4R3α和PPP4R2中也可以觀察到（圖1D）?？傊?，上述數(shù)據(jù)表明PP4C在OC中表阿達(dá)上調(diào)。
圖1 PP4亞基在卵巢癌中擴(kuò)增
作者使用CRISPR生成p53敲除ID8細(xì)胞系模型。在ID8-p53WT和ID8-p53KO中，用siRNA敲低PPP4C表明，PP4C表達(dá)的缺失導(dǎo)致這兩種細(xì)胞系對(duì)卡鉑的敏感性增加（圖2A）。WB證實(shí)轉(zhuǎn)染siRNA后PP4C的表達(dá)（圖2A）。作者通過(guò)正交試驗(yàn)獲得了PP4C穩(wěn)定敲除的ID8-p53 KO細(xì)胞。與siRNA結(jié)果一致，與載體對(duì)照或親代細(xì)胞相比，低PP4C表達(dá)的ID8-p53KO細(xì)胞對(duì)卡鉑處理越來(lái)越敏感（圖2B）。WB證實(shí)抗生素選擇后PP4C的表達(dá)（圖2B）。同樣，在ID8小鼠細(xì)胞系中，以納摩爾水平使用PP4的藥理抑制劑fostriecin治療也導(dǎo)致對(duì)卡鉑的敏感性增強(qiáng)（圖2C）。與卡鉑單獨(dú)處理相比，fostriecin和卡鉑聯(lián)合處理ID8-p53KO和人OC細(xì)胞系OVCAR3和OVCAR8的集結(jié)腸形成能力下降（圖2D-E）。這些發(fā)現(xiàn)表明抑制PP4活性可導(dǎo)致OC卡鉑敏感性增加。細(xì)胞熱位移實(shí)驗(yàn)（CETSA）表明fostriecin處理提高PP4C蛋白的熱穩(wěn)定性，這證實(shí)PP4C是fostriecin在OC細(xì)胞系中的直接靶點(diǎn)（圖2F）。
圖2 PP4抑制或敲除使卵巢癌細(xì)胞系對(duì)卡鉑敏感
3、抑制PP4C可增強(qiáng)卡鉑誘導(dǎo)的DNA損傷
作者發(fā)現(xiàn)，fostriecin聯(lián)合卡鉑抑制PP4導(dǎo)致多個(gè)OC細(xì)胞系微核形成增加（圖3A）。作者試圖確定fostriecin處理是否影響H2AX（S139）磷酸化（γ-H2AX），結(jié)果表明，fostriecin與卡鉑聯(lián)合治療可增加γ-H2AX病灶的數(shù)量（圖3B），γ-H2AX焦點(diǎn)強(qiáng)度，以及OC細(xì)胞整體γ-H2AX水平。由于已知卡鉑可以誘導(dǎo)鏈間交聯(lián)（interstrand crosslinks，ICLs），作者接下來(lái)研究是否FANCD2焦點(diǎn)，ICLs的關(guān)鍵傳感器，被PP4抑制改變。與文獻(xiàn)報(bào)道一致，作者發(fā)現(xiàn)卡鉑治療后FANCD2焦點(diǎn)增加。然而，fostriecin處理并沒(méi)有增加每個(gè)細(xì)胞中FANCD2焦點(diǎn)的數(shù)量（圖3B）。用RAD51抑制劑處理的細(xì)胞，B-02，作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)siRNA或fostriecin處理PPP4C可以抑制DR-GFP細(xì)胞系的HR（圖3C）。這些數(shù)據(jù)表明，抑制PP4導(dǎo)致增加卡鉑治療后OC細(xì)胞系DNA損傷和基因組不穩(wěn)定性標(biāo)記。
圖3 PP4的藥理抑制增強(qiáng)卡鉑誘導(dǎo)的DNA損傷
4、PP4抑制促進(jìn)OC炎癥信號(hào)通路
由于抑制PP4后觀察到的微核增加（圖3A），作者推測(cè)在PP4活性喪失的情況下，OC細(xì)胞中炎癥信號(hào)會(huì)增加。STAT1的完全轉(zhuǎn)錄激活需要額外的S727磷酸化。作者發(fā)現(xiàn)，與卡鉑單獨(dú)處理相比，fostriecin和卡鉑聯(lián)合處理導(dǎo)致OC細(xì)胞系中STAT1（Y701）磷酸化增加（圖4A）。與fostriecin治療相似，PPP4C聯(lián)合卡鉑也導(dǎo)致OC細(xì)胞系中STAT1激活增加（圖4B）。作者在OVCAR3和OVCAR8細(xì)胞中觀察到磷酸化p65在福司曲星和卡鉑作用下顯著上調(diào)（圖4C）。siRNA聯(lián)合卡鉑處理敲低PPP4C表達(dá)后，經(jīng)典的NF-kB（p65）也被激活（圖4D）。在mRNA水平，發(fā)現(xiàn)卡鉑與fostriecin或PPP4C siRNA聯(lián)合處理后，IFNB1、CCL5、CXCL10和IL - 6增加（圖4E）。而且，作者還觀察到PP4C敲低后，額外的衰老相關(guān)分泌表型（SASP）相關(guān)細(xì)胞因子IL - 8、CCL2、TNF - α和CXCL9表達(dá)增加（圖4F）。總之，這些數(shù)據(jù)表明抑制PP4增強(qiáng)卡鉑誘導(dǎo)的OC細(xì)胞系中的炎癥信號(hào)。
圖4 PP4活性的缺失增強(qiáng)了DNA損傷誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)
5、PP4在OC細(xì)胞中的抑制促進(jìn)了通過(guò)STING途徑的免疫細(xì)胞遷移
將小鼠OT - I CD8 T細(xì)胞或NK - 92細(xì)胞分別置于含有小鼠或人OC條件培養(yǎng)基的Boyden小室中（圖5A）。當(dāng)小鼠CD8 T細(xì)胞和NK - 92細(xì)胞暴露于fostriecin和卡鉑聯(lián)合處理的OC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，表現(xiàn)出增強(qiáng)的遷移能力（圖5A）。與文獻(xiàn)報(bào)道的Rac信號(hào)在趨化因子誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移中的作用一致，作者觀察到在Rac抑制劑存在的情況下，CD8 T和NK細(xì)胞的遷移顯著減少（圖5B）。然而，作者觀察到MEK和STAT3抑制劑的細(xì)胞類型特異性反應(yīng)。STAT3抑制劑Stattic抑制CD8 T細(xì)胞遷移，但增加NK - 92細(xì)胞遷移（圖5B）。與STAT3信號(hào)類似，MEK抑制也導(dǎo)致CD8 T和NK細(xì)胞的不同細(xì)胞反應(yīng)。有趣的是，MEK抑制劑抑制NK細(xì)胞遷移，而CD8 T細(xì)胞遷移不受影響（圖5B）。為確定c GAS - STING信號(hào)是否在觀察到的T和NK細(xì)胞遷移增加中發(fā)揮作用，作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)STING1敲低的OVCAR8細(xì)胞條件培養(yǎng)基抑制PP4后不能刺激人CD8 T細(xì)胞遷移（圖5C）。這些數(shù)據(jù)表明，在OC細(xì)胞中，PP4抑制刺激的促炎信號(hào)是通過(guò)STING激活介導(dǎo)的。
圖5蛋白磷酸酶4在卵巢癌細(xì)胞中的下調(diào)增強(qiáng)了效應(yīng)免疫細(xì)胞的遷移
6、在腫瘤細(xì)胞中敲低PP4C增強(qiáng)NK細(xì)胞的活化和對(duì)OC的細(xì)胞毒性
作者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PPP4C或PPP4R3B敲低后IFN - γ + NK細(xì)胞顯著增加，而卡鉑進(jìn)一步增加了IFN - γ + NK細(xì)胞（圖6A-B）。作者接下來(lái)評(píng)估NK - 92細(xì)胞與轉(zhuǎn)染對(duì)照、PPP4C或PPP4R3B siRNA的OVCAR8細(xì)胞共培養(yǎng)3小時(shí)后NK細(xì)胞脫顆粒情況，發(fā)現(xiàn)CD107a + NK - 92細(xì)胞對(duì)PPP4C或PPP4R3B的敲低反應(yīng)顯著增加。作者還觀察到與卡鉑處理的細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CD107a + NK - 92細(xì)胞群顯著增加（圖6C）。為進(jìn)一步確定PP4缺失介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化和脫顆粒的增加是否有助于NK細(xì)胞介導(dǎo)的OC細(xì)胞殺傷的增加，作者將轉(zhuǎn)染對(duì)照、PPP4C或PPP4R3B siRNA的OC細(xì)胞系與NK - 92細(xì)胞共培養(yǎng)。作者的結(jié)果表明，在OC中PPP4C或PPP4R3B的表達(dá)缺失增強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的OC細(xì)胞殺傷（圖6D）?？ㄣK處理導(dǎo)致OVCAR8細(xì)胞的殺傷顯著增加，在PP4C和PPP4R3β敲低的細(xì)胞中進(jìn)一步增加（圖6D）。因此，PP4的缺失促進(jìn)NK細(xì)胞活化和NK細(xì)胞定向的卵巢癌殺傷。
圖6PP4的缺失促進(jìn)NK細(xì)胞活化和NK細(xì)胞定向的卵巢癌殺傷
7、在一個(gè)同基因的、具有免疫功能的OC小鼠模型中，敲低PP4C會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)減少和效應(yīng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增加
接下來(lái)，作者試圖評(píng)估PP4C敲低對(duì)OC腫瘤生長(zhǎng)的影響。研究構(gòu)建了PP4C表達(dá)降低的ID8 - p53KO細(xì)胞（圖2B）。在體內(nèi)，PP4C敲低導(dǎo)致整體腫瘤生長(zhǎng)顯著降低（圖7A-B）。此外，與對(duì)照組相比，PP4C敲低的腫瘤中腹水形成顯著減少（圖7C）。接下來(lái)，作者測(cè)定了腫瘤、脾臟、腹腔淋巴結(jié)和腹水中的細(xì)胞變化，觀察到，與對(duì)照組相比，PP4C shRNA腫瘤中NK細(xì)胞( CD3-CD161 + )和NK T細(xì)胞( CD3 + CD161 + )浸潤(rùn)均顯著增加（圖7D-I），而卡鉑治療后沒(méi)有額外增加（圖7D-E）。與浸潤(rùn)增加一致，作者在PP4C shRNA腫瘤中也發(fā)現(xiàn)IFN - γ+ NK細(xì)胞( CD3-CD161 + )增加（圖7F）。此外，作者觀察到PP4C shRNA腫瘤內(nèi)CD4 + T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且不受卡鉑處理的影響（圖7G）。有趣的是，在PP4C shRNA腫瘤中，卡鉑治療顯著增加了腫瘤內(nèi)CD8 + T細(xì)胞的數(shù)量，而在對(duì)照組中沒(méi)有觀察到（圖7H）。此外，作者發(fā)現(xiàn)作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞代表的CD4 + CD25 + T細(xì)胞群在所有組別中保持不變（圖7I）。這些數(shù)據(jù)表明抑制PP4C降低腫瘤負(fù)擔(dān)，增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)。
圖7抑制PP4C增強(qiáng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)
結(jié)論：
綜上所述，本研究突出了PP4在抗腫瘤免疫中的作用以及需要特異性抑制劑進(jìn)行有效的臨床轉(zhuǎn)譯。據(jù)作者所知，這是第一份證明在癌細(xì)胞中敲除或抑制PP4會(huì)增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞的遷移、功能和腫瘤浸潤(rùn)的報(bào)告。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，作者認(rèn)為PP4是OC中一個(gè)有吸引力的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。
圖8 PP4C參與抗免疫抑制的機(jī)制圖
參考文獻(xiàn)：
Raja R, Wu C, Bassoy EY, Rubino TE Jr, Utagawa EC, Magtibay PM, Butler KA, Curtis M. (2022) PP4 inhibition sensitizes ovarian cancer to NK cell-mediated cytotoxicity via STAT1 activation and inflammatory signaling. J Immunother Cancer. 10(12):e005026. doi: 10.1136/jitc-2022-005026. PMID: 36564125