METTL3通過介導(dǎo)乳腺癌中LATS1的m6A甲基化來調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和糖酵解

欄目：最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間：2023-03-10
我們發(fā)現(xiàn)METTL3-LATS1-YTHDF2通路通過激活Hippo通路中的YAP/TAZ在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本文于......

腫瘤相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄后修飾在乳腺癌進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。然而，潛在的機(jī)制仍然未知。癌細(xì)胞中的m6A修飾是動(dòng)態(tài)和可逆的，并已發(fā)現(xiàn)通過各種機(jī)制影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。本研究探討了Hippo通路中m6A甲基化對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和代謝的調(diào)控機(jī)制。我們通過Hippo通路因子LATS1證明m6A調(diào)控在乳腺癌的增殖和糖酵解代謝中發(fā)揮重要作用。METTL3被鑒定為m6A的writer，YTHDF2被鑒定為LATS1 mRNA的閱讀蛋白，在乳腺癌的腫瘤發(fā)生和糖酵解中都有積極的促進(jìn)作用。METTL3在LATS1 mRNA中誘導(dǎo)了高水平的m6A修飾。YTHDF2識(shí)別了LATS1 mRNA中的m6A位點(diǎn)，降低了其穩(wěn)定性。敲除METTL3或YTHDF2蛋白表達(dá)，通過激活Hippo通路中的YAP/TAZ，增加LATS1 mRNA的表達(dá)，抑制乳腺癌的腫瘤發(fā)生。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)METTL3-LATS1-YTHDF2通路通過激活Hippo通路中的YAP/TAZ在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本文于2023年1月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。


技術(shù)路線



結(jié)果：

1）乳腺癌中m6A修飾的mRNA的異常表達(dá)與Hippo通路有關(guān)

為了研究乳腺癌組織樣本中m6A修飾水平，對(duì)配對(duì)的乳腺導(dǎo)管癌組織和相鄰的正常乳腺組織樣本進(jìn)行MeRIP-seq。通過分析測(cè)序數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)癌組織中存在大量差異甲基化或修飾的mRNAs(圖1a)。每一對(duì)的差異富集峰顯示，腫瘤組織中超過一半的m6A特異性位點(diǎn)富集，并出現(xiàn)在經(jīng)典的mRNA修飾區(qū)域附近，即外顯子、3 ' UTR和終止密碼子(圖1b)。圖1c顯示了差異表達(dá)的m6A mRNA與差異表達(dá)基因的聯(lián)合分析結(jié)果。對(duì)這些差異表達(dá)基因的功能富集分析(圖1d)進(jìn)一步揭示m6A修飾在調(diào)控多種癌癥和信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，如MAPK，Hippo和PI3K-Akt信號(hào)通路。值得注意的是，Hippo途徑中的基因被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中有差異的修飾和表達(dá)(圖1d)。Hippo通路是參與癌癥發(fā)展的重要增殖調(diào)節(jié)通路。結(jié)果表明，腫瘤抑制因子LATS1的m6A修飾可能參與mRNA表達(dá)下調(diào)和細(xì)胞代謝過程的負(fù)調(diào)控。MeRIP-seq結(jié)果顯示，LATS1 mRNA的m6A修飾水平在兩個(gè)以上位點(diǎn)顯著上調(diào)(圖1e)。為了確定乳腺癌中LATS1中m6A修飾的機(jī)制，我們使用SRAMP預(yù)測(cè)LATS1 mRNA中的m6A位點(diǎn)(圖1e)。如圖1f所示， METTL3被預(yù)測(cè)為MDAMB-231乳腺癌細(xì)胞m6A修飾過程中LATS1 mRNA的結(jié)合蛋白。


 

2）乳腺癌組織和細(xì)胞中METTL3的表達(dá)

為了研究METTL3在乳腺癌中的表達(dá)，我們檢測(cè)了其在乳腺癌組織和配對(duì)的正常組織中的蛋白水平。如圖2a所示，METTL3在乳腺導(dǎo)管癌組織中高表達(dá)。對(duì)乳腺癌組織微陣列進(jìn)行免疫組化(IHC)結(jié)果顯示，METTL3主要表達(dá)在癌組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，少量表達(dá)在細(xì)胞膜上(圖2b)。Kaplan-Meier生存分析顯示，METTL3蛋白高表達(dá)與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和腔內(nèi)乳腺癌組織不良預(yù)后顯著相關(guān)(圖2c)。此外，我們?cè)诹N不同的乳腺癌細(xì)胞類型中檢測(cè)了METTL3的蛋白水平。結(jié)果如圖2d所示。METTL3在T47D細(xì)胞中表達(dá)量最高，MCF-7細(xì)胞次之，MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)量最低。



3）METTL3在體外和體內(nèi)均促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生

我們通過在MCF-7和T47D細(xì)胞中敲除或過表達(dá)METTL3來檢測(cè)METTL3在乳腺腫瘤發(fā)生中的作用。缺失METTL3后，T細(xì)胞增殖和存活明顯受到抑制(圖3a-b)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，缺失METTL3抑制MCF-7和T47D細(xì)胞的遷移和侵襲(圖3d)。在免疫缺陷小鼠中，敲除MCF-7和T47D細(xì)胞中的METTL3可以抑制相應(yīng)細(xì)胞形成腫瘤的生長(zhǎng)，而過表達(dá)METTL3則可以顯著促進(jìn)移植瘤的生長(zhǎng)(圖3e)。基于這些數(shù)據(jù)，我們證實(shí)了METTL3在乳腺癌發(fā)生中的重要作用。


 

4）METTL3影響乳腺癌細(xì)胞的Hippo途徑和糖酵解

RNA-seq檢測(cè)METTL3對(duì)MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的影響。METTL3的表達(dá)顯著增加了2845個(gè)轉(zhuǎn)錄本，減少了2044個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)(圖4a)。KEGG分析顯示，Hippo途徑和糖酵解與METTL3表達(dá)顯著相關(guān)(圖4b)。此外，對(duì)差異表達(dá)基因的途徑富集分析表明，METTL3與乳腺癌和Hippo途徑顯著相關(guān)(圖4c)。由于RNA-seq揭示METTL3可能與乳腺腫瘤細(xì)胞的糖酵解有關(guān)，我們對(duì)METTL3 KO MCF-7乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。差異代謝產(chǎn)物KEGG分析進(jìn)一步證明METTL3的表達(dá)參與了癌癥的中樞碳代謝，尤其是糖酵解和糖異生作用(圖4d)。


 

5）METTL3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的糖酵解和集落形成能力

為了了解METTL3促進(jìn)乳腺癌糖酵解的機(jī)制，我們?cè)u(píng)估了METTL3對(duì)MCF-7和T47D細(xì)胞糖酵解的影響。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)METTL3的缺失降低了乳腺癌細(xì)胞系的糖酵解活性(圖5a-b)。由于Hippo通路參與癌癥發(fā)展是眾所周知的，我們預(yù)測(cè)METTL3可能介導(dǎo)LATS1的m6A修飾，并進(jìn)一步影響Hippo通路。通過RNA下拉實(shí)驗(yàn)和western blotting，我們證實(shí)了LATS1 mRNA和METTL3之間的相互作用(圖5c)。MeRIP-qPCR結(jié)果顯示METTL3的存在直接增加了LATS1 mRNA的m6A水平(圖5d)。為了確定LATS1 mRNA與METTL3相互作用的區(qū)域，我們檢測(cè)了METTL3和LATS1 mRNA之間的相互作用。突變位點(diǎn)基于MeRIP-seq和SRAMP預(yù)測(cè)結(jié)果。MeRIP-qPCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)METTL3的調(diào)控介導(dǎo)了LATS1 mRNA的m6A甲基化(圖5e)。為了研究m6A調(diào)控對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和酵解的影響，我們進(jìn)行了集落形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示METTL3敲除后抑制LATS1可以挽救乳腺癌細(xì)胞的增殖(圖5f)。此外，海馬實(shí)驗(yàn)顯示，在乳腺癌細(xì)胞中，敲低METTL3表達(dá)后，抑制LATS1表達(dá)，糖酵解上調(diào)(圖5g)。



6）YTHDF2參與m6A對(duì)LATS1 mRNA的調(diào)控

由于MeRIP-seq檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LATS1 mRNA有較高的m6A修飾水平，我們的目的是確定哪些m6A閱讀器可以直接識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)并調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中LATS1的表達(dá)。LATS1 mRNA的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，缺失METTL3促進(jìn)了mRNA的穩(wěn)定性(圖6a)，而突變LATS1 mRNA中的m6A位點(diǎn)也增強(qiáng)了這種穩(wěn)定性(圖6b)。使用RNA下拉實(shí)驗(yàn)和western blotting，我們發(fā)現(xiàn)YTHDF2是LATS1 mRNA的m6A閱讀器(圖6c)。我們發(fā)現(xiàn)METTL3的表達(dá)對(duì)FTO和YTHDF2的表達(dá)沒有影響(圖6d)。而LATS1蛋白水平與YTHDF2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖6e)。為了確定YTHDF2在乳腺癌細(xì)胞中的影響，并了解其在腫瘤發(fā)生和糖酵解過程中LATS1 mRNA m6A甲基化中的作用，我們改變了YTHDF2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)(圖6e)。我們發(fā)現(xiàn)LATS1的m6A甲基化下調(diào)了乳腺癌細(xì)胞中LATS1的表達(dá)(圖5d, 6e)，并通過抑制其磷酸化激活YAP/TAZ(圖6f)。在誘導(dǎo)METTL3表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了高水平的YAP/TAZ，而敲低YTHDF2的表達(dá)可以糾正細(xì)胞核中的這種偏移表達(dá)(圖6f)。海馬實(shí)驗(yàn)顯示YTHDF2對(duì)乳腺癌細(xì)胞的糖酵解有積極作用(圖7a)。YTHDF2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)在體外和體內(nèi)都促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生(圖7b-c)。由于YTHDF2通過讀取LATS1中的m6A甲基化使LATS1 mRNA失穩(wěn)，我們預(yù)測(cè)敲低YTHDF2的表達(dá)可以促進(jìn)LATS1的抑瘤作用。與這一假設(shè)相一致的是，YTHDF2的缺失抑制了腫瘤的增殖、生存和侵襲，而這種抑制腫瘤的作用通過抑制LATS1的表達(dá)得以恢復(fù)(圖7c-f)。



 

結(jié)論：

我們發(fā)現(xiàn)了LATS1 mRNA的負(fù)向調(diào)控機(jī)制，即METTL3介導(dǎo)LATS1 mRNA中某些位點(diǎn)的m6A修飾，而這種修飾被YTHDF2識(shí)別。因此，乳腺癌中LATS1的表達(dá)和Hippo通路蛋白的磷酸化被抑制，最終導(dǎo)致糖酵解和腫瘤的發(fā)展。


參考文獻(xiàn)：

Xu Y, Song M, Hong Z, Chen W, Zhang Q, Zhou J, Yang C, He Z, Yu J, Peng X, Zhu Q, Li S, Ji K, Liu M, Zuo Q. The N6-methyladenosine METTL3 regulates tumorigenesis and glycolysis by mediating m6A methylation of the tumor suppressor LATS1 in breast cancer. J ExpClin Cancer Res. 2023 Jan 7;42(1):10. doi: 10.1186/s13046-022-02581-1.