LINC01018/miR-942-5p/KNG1軸調(diào)控膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外惡性發(fā)展

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，死亡率高，約占全球所有原發(fā)性腦腫瘤的60%。由于其快速增殖的能力，惡性膠質(zhì)瘤浸潤周圍正常組織的可能性很高。盡管膠質(zhì)瘤的手術(shù)聯(lián)合放化療等治療方式取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但治療結(jié)果仍然不令人滿意。到目前為止，膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機制仍然在很大程度上未知，因此很難開發(fā)出有效的膠質(zhì)瘤治療方法。因此，有必要弄清楚膠質(zhì)瘤進(jìn)展的潛在機制，并制定可行的膠質(zhì)瘤治療方法。該研究發(fā)表于《CNS Neuroscience & Therapeutics》，IF：7.035。

研究路線：

主要研究結(jié)果：

1. KNG1在腦膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，與miR-942-5p在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

采用生物信息學(xué)分析分析膠質(zhì)瘤的基因表達(dá)變化，確定膠質(zhì)瘤生成的關(guān)鍵基因。根據(jù)TargetScan，starBase，miRDB和miRWalk的預(yù)測，MiR-942-5p和miR-455-5p可能是可以靶向KNG1的miRNA（圖1A）。同時，還預(yù)測miR-942-5p和miR-455-5p高表達(dá)水平的LGG患者生存率較差（圖1B，C）。此外，利用cBioPortal分析miR-942-5p和miR-455-5p與預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示，淺缺失組和二倍體組miR-942-5p的腫瘤組織學(xué)分級和初始治療后的新發(fā)腫瘤事件與深度缺失組相比得到促進(jìn)（圖1D，E）。然后評估神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者癌癥病變和鄰近正常樣本中KNG1，miR-942-5p和miR-455-5p的水平（圖1F-I）。如圖1F、G所示，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測了神經(jīng)膠質(zhì)瘤中KNG1的低水平（圖1G），并在臨床組織中進(jìn)行了驗證（圖1F）。此外，miR-942-5p在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)（p<0.001，圖1H），而癌組織和正常組織之間的miR-455-5p水平?jīng)]有差異（p>0.05，圖1I）。此外，研究者發(fā)現(xiàn)KNG1和miR-942-5p在正常組織（r=-0.403，p=0.003）和癌組織（r=-0.447，p<0.001）中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖1J，K），而miR-455-5p和KNG1之間不存在相關(guān)性（圖1L，M）。相應(yīng)地，與NHA細(xì)胞相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中KNG1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著降低（p<0.001，圖1N，O），而膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的miR-942-5p水平信號增強（p<0.05，圖1P）。鑒于KNG1在LN-229細(xì)胞中的表達(dá)最低，在T98G細(xì)胞中的表達(dá)最高，故選擇這兩種細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1KNG1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)低，與miR-942-5p呈負(fù)相關(guān)，后者在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)

2.沉默KNG1促進(jìn)LN-229和T98G細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，而過表達(dá)KNG1則相反

在T98G和LN-229細(xì)胞中沉默或過表達(dá)KNG1以確定其在膠質(zhì)瘤中的功能。通過RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析檢測轉(zhuǎn)染效率。將siKNG1轉(zhuǎn)染到LN-229和T98G細(xì)胞后，與轉(zhuǎn)染siNC的細(xì)胞相比，KNG1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平明顯抑制（p<0.01，圖2A-D），而轉(zhuǎn)染KNG1過表達(dá)質(zhì)粒后觀察到相反的趨勢（超過兩倍水平）（p<0.001，圖 2E-H）。之后，研究者檢測到KNG1對LN-229和T98G細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（圖3A-H）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siKNG1后LN-229和T98G細(xì)胞的遷移率（圖3A，B）和侵襲率（圖3E，F）均顯著增加（p<0.05），轉(zhuǎn)染KNG1過表達(dá)質(zhì)粒后均降低（p<0.01，圖3C，D，G，H）。隨后，進(jìn)一步確定相關(guān)基因的水平以驗證上述發(fā)現(xiàn)（4A-H）。如圖4A、B、E、F所示，在轉(zhuǎn)染siKNG1的LN-229和T98G細(xì)胞中，SNAIL1，TWIST1，Vimentin，ZEB1和N-鈣粘蛋白的表達(dá)上調(diào)，E-鈣粘蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)（p<0.05）。相比之下，圖4C、D、G、H顯示KNG1過表達(dá)對上述基因在兩個細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生了相反的影響。如圖4I-L所示，轉(zhuǎn)染siKNG1導(dǎo)致兩個細(xì)胞的集落形成率明顯增加（p<0.001），而轉(zhuǎn)染KNG1過表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)致菌落形成率明顯降低（p<0.01）。所有這些結(jié)果表明，敲低KNG1增強了LN-229和T98G細(xì)胞的惡性生物學(xué)活性，而過表達(dá)KNG1則相反。

圖2 siKNG1和KNG1過表達(dá)質(zhì)粒在LN-229和T98G細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

圖3 沉默KNG1增強LN-229和T98G細(xì)胞的遷移和侵襲，而過表達(dá)KNG1則相反

圖4沉默KNG1通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因促進(jìn)LN-229和T98G細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)KNG1則相反

3. MiR-942-5p靶向KNG1并調(diào)控KNG1的表達(dá)

在驗證KNG1對T98G和LN-229膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用后，檢測到miRNA靶向KNG1。Targetsscan預(yù)測KNG1可能是miR-942-5p的目標(biāo)，因為KNG1-3'-UTR包含miR-942-5p的目標(biāo)堿基序列（圖5A）。然后研究者進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因測定以驗證這一預(yù)測（圖5B，C）。結(jié)果表明，與模擬對照+KNG1-3'-UTR組相比，模擬物+ KNG1-3'-UTR組的熒光素酶活性受到明顯抑制，而模擬物+ KNG1-3'-UTR突變組的熒光素酶活性沒有變化（p<0.001）。研究者還確定了轉(zhuǎn)染后miR-942-5p表達(dá)的變化（圖5D，E），發(fā)現(xiàn)miR-942-5p水平在轉(zhuǎn)染miR-942-5p抑制劑后明顯下調(diào)，但在轉(zhuǎn)染miR-942-5p模擬物后明顯上調(diào)約兩倍（p<0.001）。然而，siKNG1和miR-942-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染或KNG1和miR-942-5p模擬物共轉(zhuǎn)染后，miR-942-5p水平?jīng)]有明顯變化，表明KNG1不能影響miR-942-5p的表達(dá)。如圖5F、G所示，miR-942-5p抑制劑顯著上調(diào)KNG1的蛋白質(zhì)和mRNA水平（p<0.001）。然而，與siNC相比，siKNG1逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p抑制劑的促進(jìn)作用（p<0.001）。此外，在圖5H、I中可以注意到，miR-942-5p模擬物顯著降低了KNG1的蛋白質(zhì)和mRNA水平（p<0.001），過表達(dá)KNG1（p<0.001）逆轉(zhuǎn)了KNG1。所有這些發(fā)現(xiàn)表明miR-942-5p靶向KNG1并調(diào)控KNG1的表達(dá)。

圖5 MiR-942-5p靶向KNG1并調(diào)控KNG1的表達(dá)

4.過表達(dá)KNG1和敲低KNG1分別抵消了miR-942-5p模擬物和抑制劑對LN-229和T98G細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的調(diào)控作用

通過檢測遷移、侵襲和增殖速率的變化來衡量KNG1聯(lián)合miR-942-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響。如圖6A、C、E所示，miR-942-5p抑制劑（p<0.05）顯著降低了LN-229細(xì)胞的遷移，侵襲和集落形成速率，siKNG1（p<0.05）顯著逆轉(zhuǎn)了其趨勢。同時，如圖6B、D、F所示，miR-942-5p模擬物顯著提高了T98G細(xì)胞的遷移、侵襲和集落形成速率（p<0.01），KNG1（p<0.001）明顯逆轉(zhuǎn)了其趨勢。所有這些發(fā)現(xiàn)都表明miR-942-5p通過靶向KNG1來調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物活性。

圖6 KNG1逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p模擬物對LN-229和T98G細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的促進(jìn)作用，siKNG1抵消了miR-942-5p抑制劑對雙細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用

5.在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)的LINC01018特異性靶向miR-942-5p

驗證了靶向miR-942-5p/KNG1軸并在膠質(zhì)瘤中起作用的lncRNA。通過分析Ago CLIP-seq數(shù)據(jù)支持的miRNA-lncRNA相互作用，獲得9個候選lncRNA。其中，MALAT1、LINC01018和MEG3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)較低（圖7B-D），發(fā)現(xiàn)這三種是可能靶向miR-942-5p的lncRNA（圖7A）。RNA pull-down測定結(jié)果證實，miR-942-5p可以在LN-229和T98G細(xì)胞中與LINC01018和MEG3結(jié)合（圖7E，F）?？紤]到miR-942-5p與LINC01018的結(jié)合比與MEG3的結(jié)合強，因此挑選出LINC01018用于以后的應(yīng)用。之后，starBase v2.0的數(shù)據(jù)預(yù)測miR-942-5p和LINC01018之間存在結(jié)合位點（圖7G）。為了驗證這一預(yù)測，進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因測定（圖7H，I）。結(jié)果表明，與miR NC + LINC01018組和miR-942-5p + LINC01018組相比，miR-942-5p + LINC01018組的熒光素酶活性降低（p<0.001），而miR-942-5p + LINC01018 mut組的熒光素酶活性與miR NC + LINC01018 mut組相比沒有變化，這意味著LINC01018可以與miR-942-5p結(jié)合。此外，研究者還使用RIP進(jìn)一步驗證LINC01018是否可以靶向miR-942-5p（圖7J，K）。結(jié)果表明，相對于輸入組和抗Ago2組，抗IgG組析出LINC01018和miR-942-5p（p<0.001），證明miR-942-5p可被LINC01018直接靶向。

圖7 LINC01018在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，特異性靶向miR-942-5p

6.過表達(dá)和敲低LINC01018分別逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p模擬物和抑制劑對LN-229和T98G細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用

檢測LINC01018/miR-942-5p/KNG1軸對細(xì)胞遷移和侵襲的影響和分子機制。如圖8A、C所示，LN-229細(xì)胞的遷移和侵襲率因過表達(dá)LINC01018而明顯降低，但通過miR-942-5p模擬物顯著增強（p<0.05）。圖8B、D顯示，miR-942-5p抑制劑顯著抑制了T98G細(xì)胞的兩種速率，但LINC01018的shRNA顯著促進(jìn)（p<0.01）。此外，過表達(dá)LINC01018和miR-942-5p抑制劑下調(diào)了SNAIL1、Vimentin和ZO1等侵襲相關(guān)因子的蛋白和基因表達(dá)，但LINC01018和miR-942-5p模擬物的shRNA上調(diào)（p<0.05）；然而，E-鈣粘蛋白的蛋白質(zhì)和基因水平顯示出相反的變化趨勢（圖9A-D）。上述結(jié)果證實了LINC01018通過靶向miR-942-5p來調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖8 過表達(dá)和敲低LINC01018分別逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p模擬物和抑制劑對LN-229和T98G細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用

圖9 LINC01018過表達(dá)和敲低分別降低了miR-942-5p模擬物和抑制劑對LN-229和T98G細(xì)胞細(xì)胞周期分布和相關(guān)基因表達(dá)的影響

7.過表達(dá)和敲低LINC01018分別抵消了miR-942-5p模擬物和抑制劑對LN-229和T98G細(xì)胞細(xì)胞周期分布和增殖的調(diào)控作用

測試了LINC01018/miR-942-5p/KNG1軸對細(xì)胞周期和增殖的影響和分子機制。如圖9E所示，過表達(dá)LINC01018明顯增加了G1期LN229細(xì)胞的比例（p<0.001），而S期（p<0.05）和G2期（p<0.001）的過表達(dá)明顯降低了LN229細(xì)胞的比例。相比之下，miR-942-5p模擬物顯著降低了G1期（p<0.01）和G2期（p<0.05）LN229細(xì)胞的比例，顯著提高了S期（p<0.05）的LN229細(xì)胞比例。這些結(jié)果表明，miR-942-5p模擬物正向改變了LN-229細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，而過表達(dá)LINC01018產(chǎn)生了相反的效果，可以進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)miR-942-5p模擬物對細(xì)胞周期分布的陽性作用。如圖9F所示，LINC01018和miR-942-5p抑制劑的shRNA分別具有與過表達(dá)LINC01018和miR-942-5p模擬物相反的作用，LINC01018的shRNA中和了miR-942-5p抑制劑對細(xì)胞周期分布的影響。在細(xì)胞增殖方面（圖10A，B），LN-229細(xì)胞的相對集落形成受到LINC01018過表達(dá)的顯著阻礙，并通過miR-942-5p模擬物（p<0.01）促進(jìn)，而T98G細(xì)胞的相對集落形成受到LINC01018的shRNA的強烈促進(jìn)，并被miR-942-5p抑制劑阻斷（p<0.05）。此外，miR-942-5p模擬物和抑制劑對細(xì)胞增殖的影響分別被過表達(dá)和敲低LINC01018抵消。然后，研究者檢測到增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)（圖10C，D）。過表達(dá)LINC01018顯著降低了CDC25A和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)（p<0.05），明顯升高了CDKN2A的表達(dá)（p<0.01），而miR-942-5p模擬物產(chǎn)生了反向效應(yīng)，可以通過過表達(dá)LINC01018逆轉(zhuǎn)。LINC01018和miR-942-5p抑制劑的shRNA對這些蛋白的影響分別與過表達(dá)LINC01018和miR-942-5p模擬物相反，LINC01018的shRNA可以逆轉(zhuǎn)miR-942-5p抑制劑對細(xì)胞增殖的影響。所有這些發(fā)現(xiàn)都反映了LINC01018通過靶向miR-942-5p來調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

圖10 過表達(dá)和敲低LINC01018分別逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p模擬物和抑制劑對LN-229和T98G細(xì)胞增殖的影響

8. LINC01018靶向miR-942-5p調(diào)控腫瘤生長、KNG1表達(dá)和MVD

通過動物實驗驗證LINC01018靶向miR-942-5p對體內(nèi)膠質(zhì)瘤的影響。與腫瘤圖片和腫瘤重量統(tǒng)計圖一致（圖11A，B），注射LN-229細(xì)胞的小鼠腫瘤重量因過表達(dá)LINC01018而降低，但通過miR-942-5p模擬物升高，而注射T98G細(xì)胞的小鼠腫瘤重量因miR-942-5p抑制劑降低，但通過敲低LINC01018增加（p<0.001）。此外，在注射LN-229細(xì)胞的小鼠中，過表達(dá)LINC01018進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p模擬物的作用，并且在注射T98G細(xì)胞的小鼠中，miR-942-5p抑制劑的作用被敲低LINC01018抵消（p<0.001）。根據(jù)圖11C、D，LINC01018的表達(dá)在LN-229細(xì)胞中被過表達(dá)LINC01018顯著上調(diào)，但在T98G細(xì)胞中被shRNA LINC01018下調(diào)（p<0.001）。在LN-229細(xì)胞中，miR-942-5p（圖11E，F）的表達(dá)因過表達(dá)LINC01018而明顯降低，但被miR-942-5p模擬物明顯升高。在T98G細(xì)胞中，miR-942-5p的表達(dá)被miR-942-5p抑制劑顯著抑制，但被敲低LINC01018明顯促進(jìn)（p<0.01）。此外，在LN-220細(xì)胞中，過表達(dá)LINC01018顯著逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p模擬物的作用，而t98G細(xì)胞中的敲低LINC01018抵消了miR-942-5p抑制劑的作用。研究者還檢測了KNG1的蛋白質(zhì)和基因表達(dá)（圖12A，B），結(jié)果表明KNG1表達(dá)在LN-229細(xì)胞中被過表達(dá)LINC01018明確上調(diào)，但被miR-942-5p模擬物明顯下調(diào)，而KNG1表達(dá)由miR-942-5p抑制劑促進(jìn)，但在T98G細(xì)胞中被LINC01018敲低抑制（p<0.01）。此外，LINC01018在LN-229細(xì)胞中的過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p模擬物對KNG1表達(dá)的影響，而敲低LINC01018在T98G細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)了miR-942-5p抑制劑對KNG1表達(dá)的影響。免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)也進(jìn)一步驗證了這些結(jié)果（圖12C，D）。由于KNG1可以抑制血管生成，因此采用免疫組織化學(xué)檢測MVD。如圖13A、B所示，研究者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LINC01018抑制MVD，而敲低LINC01018則相反。此外，miR-942-5p模擬物和抑制劑分別顯著中和了過表達(dá)和敲低LINC01018對MVD的影響（p<0.05）。

圖11 LINC01018靶向miR-942-5p調(diào)節(jié)體內(nèi)腫瘤生長

圖12 LINC01018靶向miR-942-5p調(diào)節(jié)KNG1在體內(nèi)的表達(dá)

圖13 LINC01018靶向miR-942-5p調(diào)控微血管密度

結(jié)論：

該研究結(jié)果證實，過表達(dá)LINC01018可通過靶向miR-942-5p/KNG1軸抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲以及裸鼠膠質(zhì)瘤的生長。該研究豐富了膠質(zhì)瘤的發(fā)生機制，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

Xu J, Wang J, Zhao M, Li C, Hong S, Zhang J. LncRNA LINC01018/miR-942-5p/KNG1 axis regulates the malignant development of glioma in vitro and in vivo. CNS Neurosci Ther. 2023 Feb;29(2):691-711. doi: 10.1111/cns.14053.