circCsnk1g3和circAnkib1調(diào)控的干擾素反應在肉瘤中通過塑造免疫微環(huán)境促進腫瘤發(fā)生

外顯子環(huán)狀RNA（circRNAs）主要產(chǎn)生非編碼RNA，最近已在許多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。然而，它們對癌癥進展的功能貢獻仍然知之甚少。在這里，作者鑒定了在軟組織肉瘤細胞中表達的circRNA，并探索circRNA如何在體內(nèi)調(diào)節(jié)肉瘤的生長。作者發(fā)現(xiàn)circCsnk1g3和circAnkib1通過形成促腫瘤微環(huán)境來促進腫瘤生長，這可能是由于它們能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞外部的促腫瘤因子。因此，circCsnk1g3和circAnkib1可以控制肉瘤細胞中干擾素相關(guān)基因和促炎因子的表達，從而引導免疫細胞募集到腫瘤塊中，從而激活它們。在機制上，circRNA可能通過緩沖RIG-I介導的通路激活來抑制促炎因子，RIG-I是細胞質(zhì)病毒RNA傳感器。目前的研究結(jié)果表明，靶向特定的circRNA可以增強腫瘤的療效和對主流療法的免疫應答。本研究于2022年11月25日發(fā)表于《nature communication》，IF：17.694。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、CircAnkib1和circCsnk1g3促進肉瘤在體內(nèi)生長

為確認circRNAs在肉瘤中的表達和功能作用，作者使用了一個同基因肉瘤小鼠模型，通過對間充質(zhì)干細胞中Trp53和Ccne1基因的遺傳操作，作者產(chǎn)生了p53^KOCcne1⁺細胞，并使用熒光蛋白標記示蹤（dsRED）。隨后，將產(chǎn)生的p53^KOCcne1⁺細胞接種在生物惰性的3D支架上，并移植到同系受體小鼠的皮下（圖1a）。為確保從RNA - seq中鑒定的circRNAs在肉瘤細胞中表達，而不是在腫瘤微環(huán)境的細胞中表達。作者從生長的腫瘤中分離dsRED標記的肉瘤細胞，并通過體外RT-qPCR來評估circRNAs的表達（附圖1b）。確定12個候選circRNAs在肉瘤細胞中的特異性表達后，作者評估了這些候選circRNA在惡性細胞（p53^KOCcne1⁺）中的表達是否高于類似的非致瘤細胞（p53^KO間充質(zhì)細胞）。雖然12個circRNAs在肉瘤細胞中的平均表達量均高于非惡性間質(zhì)細胞，但其中6個circRNAs（circCamsap1、circRad23b、circBnc2、circRere、circAnkib1和circCsnk1g3）在肉瘤中顯著上調(diào)（附圖1c）。而且，這6個circRNAs具有標準circRNA的特征。經(jīng)RT-qPCR分析，作者選擇了三個頂級circRNA（circAnkib1、circCsnk1g3和circBnc2）。circAnkib1、circCsnk1g3和circBnc2在小鼠模型中進行功能研究（圖1b）。重要的是，這3個circRNAs的人類類似物不僅在UPS中被檢測到，而且在其他亞型的軟組織肉瘤中也被檢測到（圖1c）。

針對每一個circRNA，作者設(shè)計了表達靶向circRNA繩頭插接連接處的shRNA的慢病毒載體來敲除它們。重要的是，這些shCircRNAs是專門設(shè)計的，只與繩頭插接連接的序列雜交，而使線性轉(zhuǎn)錄本不受影響（圖1d，左）。shCircRNA vs shSCR肉瘤細胞（圖1d，右）的qPCR證實circRNA的特異性和高效敲低，表明shCircRNA細胞中環(huán)狀而非線狀RNA表達減少。由于這些circRNAs在惡性細胞中顯著上調(diào)，作者推測它們可能影響腫瘤的發(fā)生過程。為評估這種體內(nèi)效果，將p53^KOCcne1⁺肉瘤細胞（其中circAnkib1、circCsnk1g3和circBnc2的表達被沉默）移植到同基因免疫功能正常小鼠皮下或肺中生成肉瘤。對照組皮下腫瘤長至約1 cm³，20 d后取肺組織。值得注意的是，當circCsnk1g3和circAnkib1在肉瘤細胞中被沉默時，與對照組相比，皮下腫瘤的體積顯著減小（圖1e），腫瘤內(nèi)dsRED⁺腫瘤細胞的比例降低（圖1F）。此外，當同樣的circCsnk1g3和circAnkib1沉默的肉瘤細胞靜脈注射到尾靜脈時，它們在肺中均表現(xiàn)出明顯減少的腫瘤細胞和腫瘤灶數(shù)量（圖1g-h）。circBnc2的沉默僅輕微影響皮下肉瘤細胞的生長（圖1e），并不影響肺內(nèi)腫瘤負荷（圖1g）。雖然circAnkib1和circCsnk1g3的沉默對體內(nèi)腫瘤生長有顯著影響，但使用針對線性異構(gòu)體的shRNA沉默線性Ankib1和Csnk1g3轉(zhuǎn)錄本并不影響腫瘤生長（圖1i-j）。這些結(jié)果說明，來自同一基因的線性和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本（共享部分核苷酸序列）在癌癥中可以獨立發(fā)揮作用。此外，這些數(shù)據(jù)表明CircAnkib1和circCsnk1g3可以促進肉瘤在體內(nèi)生長。

圖1CircAnkib1和circCsnk1g3促進肉瘤在體內(nèi)生長

附圖1b

附圖1c

2、circRNAs在腫瘤細胞中調(diào)節(jié)干擾素信號和促炎細胞因子的表達

為探究circCsnk1g3和circAnkib1如何促進肉瘤生長，作者研究這些circRNA在肉瘤細胞中調(diào)控的腫瘤相關(guān)通路?；蚣患治鲲@示，敲低circAnkib1和circCsnk1g3后，I型和II型干擾素的產(chǎn)生和應答相關(guān)的信號通路上調(diào)（圖2a）。與此一致，作者對篩選出的基因進行RT-qPCR發(fā)現(xiàn)沉默circAnkib1和circCsnk1g3后，腫瘤細胞中干擾素相關(guān)基因（如Ifit3、Isg15、Ifih1、Oasl2、Irf7等）和促炎細胞因子（如Cxcl10、Cxcl9、Ccl3和Ccl5）的表達增加（圖2b）。為驗證這些觀察結(jié)果是否可以在蛋白水平得到證實，作者在circCsnk1g3沉默的細胞上使用了反相蛋白質(zhì)芯片（RPPA）。隨后進行WB驗證，發(fā)現(xiàn)在circCsnk1g3沉默的肉瘤細胞中，與對照組相比，RPPA上調(diào)了NF κB、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）和胰島素受體底物（IRSs）的表達，這些因子通過干擾素信號通路發(fā)揮作用（圖2c）。有趣的是，盡管表達這些炎癥因子，沉默circCsnk1g3的細胞表達的STAT1比對照細胞少。這表明circCsnk1g3沉默細胞中炎癥機制的激活可能來源于細胞內(nèi)信號；有趣的是，通路分析顯示細胞內(nèi)病毒RNA感應機制上調(diào)（圖2a）。同時，對照細胞表達更多的STAT3和STAT5，其中STAT3是IL - 10和IL - 6誘導信號的主要中介，而STAT5與抑制抗腫瘤免疫和減少腫瘤對IFNα刺激的反應有關(guān)。此外，WB結(jié)果顯示，在circCsnk1g3和circAnkib1沉默的腫瘤細胞中，干擾素和炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵信號元件IRF1和pTBK的表達增強，與RNA水平的數(shù)據(jù)一致（圖2d）。重要的是，促炎通路的表達增加是由circRNA沉默所特有的，而線性轉(zhuǎn)錄本的敲低并沒有表現(xiàn)出這種效應，甚至有相反的趨勢。

接下來，作者旨在研究這些circRNA在肉瘤細胞中調(diào)控干擾素和促炎信號的分子機制。circAnkib1和circCsnk1g3都具有抗炎能力，因此，作者推測circAnkib1和circCsnk1g3可以與dsRNA（模式識別受體和抗病毒免疫介質(zhì)的雙鏈RNA）結(jié)合蛋白相互作用，如PKR、MDA5和RIG - I。由于這些病毒RNA感應機制主要是細胞質(zhì)，作者首先采用細胞核/細胞質(zhì)分離的方法，確定circAnkib1和circCsnk1g3也優(yōu)先定位于細胞質(zhì)（圖2f）。RNA靶向熒光原位雜交（一種用來區(qū)分圓形和線性RNA異構(gòu)體的特別技術(shù)，circFISH）確認細胞質(zhì)定位（圖2g-h）。通過RNase - R處理線性RNA降解來驗證circFISH信號的環(huán)狀和線性特異性（圖2i）。

圖2 circRNAs在腫瘤細胞中調(diào)節(jié)干擾素信號和促炎細胞因子的表達

3、circRNA通過RIG-I調(diào)控干擾素基因的表達

除PKR外，其他幾種蛋白（MDA5、RIG - I）具有與病毒RNA結(jié)合并觸發(fā)干擾素和炎癥反應的能力。因此，作者研究MDA5和RIG - I是否也能感應內(nèi)源性circRNA。首先，作者通過檢測MDA5和RIG - I沉默后的干擾素信號來評估這些蛋白在肉瘤細胞中的活化狀態(tài)。Ddx58（編碼RIG - I）的敲低顯著降低腫瘤細胞中干擾素信號和促炎細胞因子的表達（圖3a）。相反，Ifih1（編碼MDA5）的沉默僅輕微改變這些元件的表達（圖3b）。因此，作者進一步研究circRNAs抑制炎癥信號的能力是否依賴于RIG - I。作者構(gòu)建RIG - I shRNA沉默（RIG-I KD）的肉瘤細胞，與RIG - I野生型（RIG - I WT）細胞相比，作者檢測circRNAs在RIGI KD細胞中調(diào)節(jié)炎癥信號的能力。當分別沉默circCsnk1g3或circAnkib1后，RIG-I WT細胞中干擾素相關(guān)基因和促炎因子均增加，與預期一致（圖3c）。然而，這種增加在RIG - I KD條件下被顯著抑制（圖3c）。

由于RIG - I可以直接結(jié)合病毒RNA，作者接下來試圖確定circRNA是否也可以與RIG - I發(fā)生物理相互作用。采用反向下拉評估RIG-I和circRNA的相互作用

RIG - I免疫沉淀后，對下拉材料進行RT-qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)circCsnk1g3和circAnkib1富集（圖3d）。RIG - I與circRNAs的相互作用也由間歇拉片反向評估，采用改編形式的CRISPR - assisted RNA-protein interaction detection（CARPID）。簡而言之，在肉瘤細胞中表達與生物素連接酶BASU融合的催化死亡Cas Rx蛋白( BASU-dCasRx )，同時靶向circRNA的剪接連接處的sgRNAs引導BASU-dCasRx在circCsnk1g3和circAnkib1附近的蛋白質(zhì)上添加生物素殘基（圖3e）。當生物素下拉時，可以在與circCsnk1g3和circAnkib1相互作用的生物素化蛋白中可以檢測到RIG – I（圖3f）。

為進一步驗證RIG – I是肉瘤細胞干擾素信號和炎癥因子表達的主要啟動子，且內(nèi)源性circRNA可能降低其激活，作者研究了在p53^KOCcne1⁺肉瘤細胞中存在內(nèi)源性dsRNA，它們觸發(fā)炎癥活動，以及內(nèi)源性circAnkib1和circCsnk1g3限制病毒模擬反應的可能性（圖3g）。與這些假設(shè)一致，dsRNA在穩(wěn)態(tài)的肉瘤細胞中檢測到（用J2抗體）（圖3h），并且在abemaciclib（CDK4/6抑制劑）處理后進一步升高（圖3i）。此外，abemaciclib處理除了增加dsRNA表達外，還增加肉瘤細胞中干擾素和促炎因子的表達（圖3j）。最后，在abemaciclib處理的肉瘤細胞中，circCsnk1g3的沉默進一步增加這些基因的表達（圖3k），表明靶向circRNAs可以增強abemaciclib對肉瘤細胞病毒模擬反應的影響，并可能對抗腫瘤免疫產(chǎn)生影響。因此，circAnkib1和circCsnk1g3通過RIG - I介導的途徑調(diào)節(jié)肉瘤細胞中干擾素和促炎信號的表達。

圖3circRNA通過RIG-I調(diào)控干擾素基因的表達

4、circRNA的沉默影響免疫的TME格局

為驗證circCsnk1g3和circAnkib1通過影響腫瘤微環(huán)境中的整體免疫景觀來調(diào)節(jié)腫瘤生長的可能性，作者對circCsnk1g3表達或沉默的p53^KOCcne1⁺細胞產(chǎn)生的肉瘤TME進行比較分析。首先，流式細胞術(shù)檢測腫瘤與免疫細胞的比例。與對照組相比，circCsnk1g3沉默的腫瘤細胞與T細胞（CD4⁺和CD8⁺）的比例顯著降低（圖4a）。然后，為更好地確定這些腫瘤中浸潤的免疫細胞的亞型，并表征circCsnk1g3在腫瘤細胞中敲低后的轉(zhuǎn)錄變化，作者對腫瘤細胞進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），用Chromium平臺（10X Genomics）解離并捕獲皮下肉瘤（shSCR和shCircCsnk1g3，每組n = 4只小鼠）。（圖4b）。通過硅質(zhì)控制去除死細胞和雙胞體，作者鑒定出9個跨條件檢測到的高水平簇，代表腫瘤細胞和TME的主要細胞群（圖4c）。根據(jù)之前發(fā)表的標記對主要的免疫TME亞群進行注釋后，作者通過單獨的亞聚類將NK和T淋巴細胞作為重點（圖4d）。

作者比較了每種條件下每種細胞類型的相對豐度和不同條件下每種細胞類型的表達譜的變化。區(qū)分4個CD4⁺ T細胞群，包括表達Foxp3、Il2ra、Ikzf2、Tnfrsf4和Ctla4的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）和表達Ramp3、Rora和Odc1的CD4⁺輔助性T細胞（Th）。作者鑒定了兩群表達Foxp1和Lef1以及Ccr7或Tcf7的幼稚型CD4⁺ T細胞。同時檢測表達Gzmk、Cxcr6、Ccl5、Grap2或NK受體Klra6、Klra7、Klrk1、Klrd1的細胞毒性CD8⁺細胞。此外，單獨的CD8⁺ T細胞群表現(xiàn)出耗竭標志物Lag3和Pdcd1。通過比較這些細胞類型在不同條件下的相對豐度，作者發(fā)現(xiàn)沉默circCsnk1g3與Treg和耗竭性CD8⁺ T細胞的減少趨勢相關(guān)；相反，細胞毒性CD8⁺ T細胞則呈現(xiàn)相反的趨勢（圖4e）。檢測不同條件下的差異表達基因，作者發(fā)現(xiàn)在沉默circCsnk1g3的腫瘤中，與對照腫瘤相比，CD4⁺ T細胞平均表達更低水平的Treg相關(guān)基因，包括Tnfrsf9、Tnfrsf4、Ikzf2、Il2ra和Ctla4（圖4f）。更重要的是，免疫熒光染色證實，circRNA-KD腫瘤內(nèi)腫瘤實質(zhì)中CD3⁺ T細胞浸潤增加，而對照腫瘤中T細胞主要聚集在腫瘤邊緣（圖4g-h）。這些觀察結(jié)果證實circRNA沉默可以增強抗腫瘤T細胞反應。接下來，為進一步證實T細胞參與circRNA介導的功能，作者比較WT和circRNA沉默的肉瘤細胞在不攜帶T淋巴細胞的免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的生長情況。在免疫正常小鼠中，circCsnk1g3和circAnkib1的沉默降低腫瘤的生長（圖1），而在免疫缺陷小鼠品系中，circRNAs的沉默不影響腫瘤的生長（圖4i），表明包括T細胞在內(nèi)的完整功能的免疫系統(tǒng)是這些circRNAs發(fā)揮促腫瘤作用是必要的。

這些數(shù)據(jù)表明，在肉瘤細胞中沉默circCsnk1g3顯著改變整個TME免疫景觀，從細胞群體的相對數(shù)量、它們的轉(zhuǎn)錄活性和T細胞在腫瘤邊界以外的浸潤到更低的腫瘤允許條件，這可能有助于觀察到的腫瘤生長減少。

圖4靶向腫瘤細胞中的circRNAs重塑腫瘤微環(huán)境

結(jié)論：

circCsnk1g3和circAnkib1通過限制腫瘤細胞中干擾素和促炎鏡子的表達來促進肉瘤的生長。這一作用阻礙腫瘤塊內(nèi)免疫細胞的招募和激活，從而促進腫瘤微環(huán)境的形成。

參考文獻：

Piras R, ^KO EY, Barrett C, De Simone M, Lin X, Broz MT, Tessaro FHG, Castillo-Martin M, Cordon-Cardo C, Goodridge HS, Di Vizio D, Batish M, Lawrenson K, Chen YG, Chan KS, Guarnerio J(2022). circCsnk1g3- and circAnkib1-regulated interferon responses in sarcoma promote tumorigenesis by shaping the immune microenvironment. Nat Commun. 2022;13(1):7243. doi: 10.1038/s41467-022-34872-8.