Rab31通過Twist1介導(dǎo)的EMT促進(jìn)胃腺癌轉(zhuǎn)移和順鉑耐藥

欄目：最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間：2023-03-22
我們的數(shù)據(jù)不僅發(fā)現(xiàn)了一種新的Rab31/Stat3/MUC-1/Twist1/EMT通路在STAD轉(zhuǎn)移和耐藥中的作用，而且為......


胃腺癌(STAD)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。轉(zhuǎn)移和耐藥是目前化療失敗的兩個(gè)主要原因。在這里，我們發(fā)現(xiàn)Rab31在人類STAD組織中表達(dá)上調(diào)，Rab31的高表達(dá)與低生存率密切相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)Rab31促進(jìn)人類STAD細(xì)胞的順鉑耐藥和轉(zhuǎn)移。降低Rab31表達(dá)誘導(dǎo)STAD細(xì)胞凋亡，增加順鉑敏感性；Rab31過表達(dá)的結(jié)果相反。Rab31的沉默阻止了STAD細(xì)胞的遷移，而Rab31的過表達(dá)增加了轉(zhuǎn)移潛力。進(jìn)一步的研究表明Rab31通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)途徑介導(dǎo)順鉑耐藥和轉(zhuǎn)移。此外，我們發(fā)現(xiàn)Rab31過表達(dá)和順鉑處理都會(huì)導(dǎo)致Twist1表達(dá)增加。Twist1的缺失增強(qiáng)了STAD細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，這不能通過Rab31的過表達(dá)完全逆轉(zhuǎn)。Rab31通過激活Stat3和抑制MUC-1激活Twist1。本研究還表明，敲除Rab31可抑制STAD模型小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明Rab31是一種新的、有前景的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)，可用于STAD的診斷、治療和預(yù)后預(yù)測(cè)。我們的數(shù)據(jù)不僅發(fā)現(xiàn)了一種新的Rab31/Stat3/MUC-1/Twist1/EMT通路在STAD轉(zhuǎn)移和耐藥中的作用，而且為未來探索預(yù)測(cè)和治療STAD的新策略提供了方向。本文于2023年2月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=9.685）上。

 

技術(shù)路線



結(jié)果

1）Rab31高表達(dá)與STAD患者預(yù)后不良相關(guān)

我們通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中408個(gè)STAD組織和211個(gè)正常組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)來評(píng)估Rab31的mRNA水平。與正常組織相比，STAD腫瘤組織中Rab31的表達(dá)明顯升高(圖1A)，并且隨著STAD從I期到IV期的進(jìn)展，Rab31的表達(dá)增加，在IV期Rab31的表達(dá)最高(圖1B)。此外，Rab31水平高的STAD患者OS較差(圖1C)。為了進(jìn)一步評(píng)估Rab31在STAD中的表達(dá)，我們采用免疫組化方法檢測(cè)了人STAD組織芯片中Rab31的蛋白水平。與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中Rab31明顯上調(diào)(圖1D, E)。我們還通過western blot檢測(cè)了臨床收集的組織中Rab31蛋白的水平，證實(shí)在STAD組織中Rab31明顯高于相應(yīng)的正常組織(圖1F)。Rab31水平高的患者10年生存率為43%，Rab31水平低的患者10年生存率為57%，進(jìn)一步證實(shí)了Rab31水平高與STAD患者生存率差密切相關(guān)(圖1G-H)。這些數(shù)據(jù)表明，Rab31在STAD組織中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與STAD患者預(yù)后不良相關(guān)。


 

2）Rab31促進(jìn)人STAD細(xì)胞的細(xì)胞遷移和調(diào)節(jié)順鉑敏感性

鑒于對(duì)順鉑耐藥是STAD預(yù)后不良的一個(gè)主要原因，我們?cè)噲D確定Rab31是否參與了STAD的順鉑耐藥。我們利用了三種人STAD細(xì)胞系：MGC-803、BGC-823和AGS。Rab31在MGC-803細(xì)胞中表達(dá)最低，AGS細(xì)胞中表達(dá)最高(圖2A)。順鉑治療后，所有三種人STAD細(xì)胞的細(xì)胞活力均呈劑量依賴性下降(圖2B，左)。有趣的是，AGS細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性最高(圖2B，右)。IC50與Rab31表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(圖2C)。這些結(jié)果提示Rab31的表達(dá)可能會(huì)限制順鉑在STAD細(xì)胞中的抗腫瘤活性。為了測(cè)試Rab31是否抑制順鉑的有效性，我們首先檢測(cè)了Rab31在順鉑處理的細(xì)胞中的表達(dá)是如何改變的。western blot結(jié)果顯示，在順鉑處理的三種人STAD細(xì)胞系中，Rab31蛋白水平均顯著升高(圖2D)。在三種STAD細(xì)胞中，過表達(dá)Rab31的細(xì)胞(Rab31OE)均顯示Rab31蛋白水平顯著升高，Rab31 siRNA顯著降低Rab31的表達(dá)(圖2E, F，下)。Rab31過表達(dá)導(dǎo)致順鉑處理的所有三種STAD細(xì)胞系的劑量-反應(yīng)曲線向上移位，這表明Rab31的增加增強(qiáng)了順鉑處理的STAD細(xì)胞的細(xì)胞活力(圖2E，上)。此外，三種STAD細(xì)胞系Rab31表達(dá)的降低導(dǎo)致順鉑治療劑量-反應(yīng)曲線向下移位，表明Rab31低表達(dá)可增加順鉑敏感性(圖2F，上)。通過Annexin V/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步檢測(cè)Rab31表達(dá)對(duì)順鉑耐藥的影響。在IC50濃度順鉑作用48 h后，所有STAD細(xì)胞均發(fā)生早期和晚期凋亡(圖2G)。Rab31下調(diào)顯著增加順鉑誘導(dǎo)的凋亡。有趣的是，這種效應(yīng)在內(nèi)源性Rab31水平較高的AGS細(xì)胞中最為明顯(圖2H)。此外，過表達(dá)Rab31在這三種細(xì)胞系中都減少了順鉑誘導(dǎo)的凋亡。接下來，我們通過集落形成法和transwell法研究Rab31對(duì)STAD細(xì)胞長(zhǎng)期增殖能力和轉(zhuǎn)移的影響。Rab31的下調(diào)抑制了所有三種STAD細(xì)胞系的集落形成，而Rab31的過表達(dá)則促進(jìn)了腫瘤集落的形成(圖2I-2L，上)。在transwell試驗(yàn)中，Rab31的沉默阻止了STAD細(xì)胞的遷移，而Rab31的過表達(dá)增加了轉(zhuǎn)移潛力(圖2I-2L，下)。結(jié)果表明Rab31可能促進(jìn)人STAD細(xì)胞的克隆性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。


 

3）Rab31通過EMT促進(jìn)轉(zhuǎn)移和順鉑耐藥

在人類癌癥中，EMT是一個(gè)與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞過程。為了確定EMT是否參與了Rab31誘導(dǎo)的STAD轉(zhuǎn)移和順鉑耐藥，我們?cè)谌祟?/span>STAD細(xì)胞系中檢測(cè)了Rab31表達(dá)改變時(shí)上皮細(xì)胞標(biāo)志物和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。如圖3A所示，在所有三種STAD細(xì)胞系中，Rab31的下調(diào)導(dǎo)致上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，間充質(zhì)標(biāo)志物(vimentin, MMP-2和MMP-9)表達(dá)降低。相反，Rab31過表達(dá)導(dǎo)致EMT表現(xiàn)為vimentin、MMP-2和MMP-9表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)缺失(圖3C)。然后我們探討了順鉑治療如何影響EMT。IC50濃度的順鉑作用于人STAD細(xì)胞24小時(shí)后，E-cadherin表達(dá)降低，vimentin表達(dá)增加，提示順鉑誘導(dǎo)EMT(圖3B，D)， Rab31 siRNA逆轉(zhuǎn)順鉑誘導(dǎo)的EMT過程。這些結(jié)果表明，順鉑治療期間Rab31表達(dá)增加可能促進(jìn)EMT，從而增強(qiáng)STAD細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致順鉑耐藥。



4）Rab31通過靶向MUC-1促進(jìn)twist1介導(dǎo)的EMT

為確定可能參與Rab31介導(dǎo)的STAD順鉑耐藥的EMT-TFs，利用GEPIA在線工具計(jì)算EMT-TFs表達(dá)與Rab31的相關(guān)性。結(jié)果顯示，EMT-TFs (TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2)與Rab31呈正相關(guān)(補(bǔ)充圖)。大量研究報(bào)道，與非癌性組織相比，Twist1在STAD中過表達(dá)，且Twist1高表達(dá)與進(jìn)展不良相關(guān)。然后，我們檢測(cè)Twist1是否是連接Rab31與EMT和順鉑耐藥的關(guān)鍵因子。Western Blot結(jié)果顯示，順鉑作用于AGS細(xì)胞后，Rab31和Twist1的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加(圖4a)。此外，敲低Rab31可降低AGS細(xì)胞中Twist1 mRNA的表達(dá)(圖4B)， Twist1與Rab31的表達(dá)水平呈正相關(guān)(圖4C)。有研究表明沉默MUC1-C可以抑制Twist1，從而逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌中的紫杉醇耐藥。在這里，我們研究了STAD細(xì)胞中MUC-1是否參與Rab31-Twist1信號(hào)軸。過表達(dá)Rab31導(dǎo)致AGS細(xì)胞中Twist1蛋白水平上調(diào)，MUC-1蛋白水平下調(diào)，而敲低Rab31則降低Twist1蛋白水平，MUC-1蛋白水平升高(圖4D)。此外，通過western blot檢測(cè)，MUC-1的敲除增加了AGS細(xì)胞中Twist1和Rab31的表達(dá)，而MUC-1/Rab31的雙敲除逆轉(zhuǎn)了這些變化(圖4E)。這些數(shù)據(jù)表明Rab31可能通過抑制MUC-1激活Twist1(圖4I)。然而，共免疫沉淀顯示Rab31在AGS細(xì)胞中不直接與Twist1或MUC-1相互作用(補(bǔ)充圖)。先前的研究報(bào)道MUC-1可以通過Stat3起作用。我們的數(shù)據(jù)顯示Rab31直接與Stat3相互作用(圖4F)。此外，Rab31敲低導(dǎo)致Stat3和p-Stat3蛋白水平下調(diào)，而過表達(dá)Rab31則增加了AGS細(xì)胞中Stat3和p-Stat3蛋白的表達(dá)(圖4G)。通過western blot檢測(cè)，Stat3敲低能夠下調(diào)Stat3水平，增加AGS細(xì)胞中MUC-1的表達(dá)，而過表達(dá)Rab31則逆轉(zhuǎn)了這些變化(圖4H)。我們的結(jié)果表明MUC-1是Stat3的下游靶點(diǎn)。接下來，我們研究了Rab31/Stat3/MUC-1/Twist1信號(hào)通路與STAD順鉑耐藥的關(guān)系。Twist1沉默增強(qiáng)了STAD細(xì)胞順鉑誘導(dǎo)的死亡(圖4J, K)。Rab31過表達(dá)僅輕微逆轉(zhuǎn)了Twist1敲低的作用。


 

5）Rab31沉默在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)

最后，我們探究了Rab31表達(dá)水平對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程如圖5A所示。與對(duì)照組相比，敲低Rab31抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果與順鉑治療相當(dāng)(圖5B, E)。順鉑聯(lián)合Rab31 siRNA治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)(圖5B, C)。不同治療組之間體重?zé)o差異，說明腫瘤大小的變化不是由于體重的變化(圖5D)。腫瘤組織HE染色和Ki67染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖情況。同時(shí)使用順鉑和Rab31敲低治療可以顯著減少腫瘤細(xì)胞的增殖(圖5F, G)，提示Rab31是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，可以與順鉑聯(lián)合治療STAD。


 

結(jié)論：

     Rab31通過Stat3/MUC-1/Twist1介導(dǎo)的EMT促進(jìn)STAD細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和對(duì)順鉑治療的耐藥性。我們的數(shù)據(jù)不僅確定了STAD轉(zhuǎn)移和耐藥性的新途徑，而且還指導(dǎo)我們探索未來預(yù)測(cè)和治療STAD的新策略。


參考文獻(xiàn)：

Chen K, Xu J, Tong YL, Yan JF, Pan Y, Wang WJ, Zheng L, Zheng XX, Hu C, Hu X, Shen X, Chen W. Rab31 promotes metastasis and cisplatin resistance in stomach adenocarcinoma through Twist1-mediated EMT. Cell Death Dis. 2023 Feb 13;14(2):115. doi: 10.1038/s41419-023-05596-4.