TRF-Val-CAC-016通過調(diào)控CACNA1d介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖

超過70%的胃癌（GC）新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國家，約50%發(fā)生在東亞。中國胃癌發(fā)病和死亡人數(shù)分別占全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的42.6%和45.0%，在183個(gè)國家中發(fā)病率排名第5，死亡率排名第6。因此探索GC的治療方法至關(guān)重要。作為一種新型的非編碼RNA，tRNA衍生物在GC中起著重要作用。然而tRNA衍生物參與GC的潛在機(jī)制很少被說明。該研究發(fā)表于《Cell Communication and Signaling》，IF：7.525。

研究路線：

主要研究結(jié)果：

1.胃癌組織tRFs和tiRNAs測(cè)序譜

研究者進(jìn)行了tsRNAs測(cè)序，以區(qū)分差異表達(dá)的tsRNAs（DETs）和無差異表達(dá)的tsRNAs（NDETs），最終根據(jù)譜選擇tRF-Val-CAC-016。隨后，研究者應(yīng)用層次聚類對(duì)DETs進(jìn)行分類，共得到69個(gè)上調(diào)和42個(gè)下調(diào)的DETs的層次聚類熱圖（圖1a）。研究者使用火山圖來展示差異最大的DETs，根據(jù)圖譜的foldchange（FC）（log2FC≥3或log2FC≤-3，p<0.05），在圖1b中顯示了5個(gè)下調(diào)和6個(gè)上調(diào)的tsRNAs。顯然，考慮到可行性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究者選擇tRF-Val-CAC-016進(jìn)行進(jìn)一步的研究。同時(shí)，研究者使用R gplot包完成了相關(guān)系數(shù)的熱圖來闡述GC樣品的相似性（圖1c）。

圖1 tRFs和tiRNA測(cè)序譜的GC組織

2.tRF-Val-CAC-016在胃癌組織中低表達(dá)

研究者應(yīng)用凝膠電泳驗(yàn)證tRF-Val-CAC-016的PCR產(chǎn)物，證明PCR引物的可行性，并驗(yàn)證tsRNA測(cè)序的真實(shí)性（圖2a）。如圖2b所示，tRF-Val-CAC-016的長度在50-100 bp之間，研究者進(jìn)行了Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果。熒光原位雜交檢測(cè)表明tRF-Val-CAC-016定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，但主要位于細(xì)胞質(zhì)（圖2c）。隨后在胃癌細(xì)胞系中檢測(cè)tRF-Val-CAC-016的表達(dá)水平，最終選擇NCI-N87和HGC-27（圖2d）。最后，為了確認(rèn)tRF-Val-CAC-016模擬物的效率，研究者進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，結(jié)果與研究者的預(yù)期一致（圖2e）。類似地，在40對(duì)胃癌組織中也證實(shí)了低表達(dá)水平（圖2f）。同時(shí)，在臨床病理特征方面，tRF-Val-CAC-016的表達(dá)與腫瘤大小和組織學(xué)類型顯著相關(guān)。進(jìn)一步通過對(duì)胃切除術(shù)后患者的隨訪，計(jì)算tRF-Val-CAC-016的預(yù)后結(jié)局，但結(jié)果并不顯著（圖2g）。

圖2 tRF-Val-CAC-016在GC組織中的表達(dá)顯著降低

3.tRF-Val-CAC-016抑制胃癌細(xì)胞增殖

如圖3a-b所示，tRF-Val-CAC-016在CCK-8實(shí)驗(yàn)中顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖。乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）實(shí)驗(yàn)表明，tRF-Val-CAC-016可以抑制GC的細(xì)胞復(fù)制活性，而tRF-Val-CAC-016抑制劑增強(qiáng)了GC的復(fù)制活性（圖3c-d）。同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)tRF-Val-CAC-016可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)。如圖3e-g所示，奧沙利鉑在GC中主要處理G1期。而tRF-Val-CAC-016對(duì)NCI-N87和HGC-27細(xì)胞的S期均有顯著的調(diào)節(jié)作用。集落形成實(shí)驗(yàn)中，tRF-Val-CAC-016對(duì)胃癌細(xì)胞活力的抑制作用略弱于奧沙利鉑。tRF-Val-CAC-016抑制劑增強(qiáng)了GC細(xì)胞中的集落形成能力（圖3h-i）。這些現(xiàn)象在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中得到了嚴(yán)格的解釋，如圖3j-k所示，tRF-Val-CAC-016模擬物明顯降低了CyclinD1, CyclinB, c-myc的蛋白表達(dá)。tRF-Val-CAC-016抑制劑可上調(diào)CyclinD1、CyclinB、c-myc蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比，奧沙利鉑降低了CyclinD1、c-myc的表達(dá)。

圖3tRF-Val-CAC-016抑制了GC的增殖

4.生物信息學(xué)分析

應(yīng)用miRanda和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)tsRNAs的靶基因。基于mRNA和tsRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)的匹配，揭示了一些具有顯著性的生物學(xué)位點(diǎn)-序列特征和相對(duì)保守的評(píng)分模型。結(jié)構(gòu)評(píng)分（structure score）、能量（energy）、context_plus_score等參數(shù)用于優(yōu)化tsRNAs靶基因的選擇。然后對(duì)下調(diào)或上調(diào)的tsRNAs靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。下調(diào)組GO分析如圖4a-c所示，研究者發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路顯著富集（圖4d）。在上調(diào)組中，GO分析如圖4e-g所示，研究者發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路相當(dāng)突出（圖4h）。然后，研究者將本研究中的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)與GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比較，結(jié)果表明增殖相關(guān)通路經(jīng)常被富集，并且揭示了鈣信號(hào)通路，這與CACNA1d的功能一致。

圖4測(cè)序譜的GO和KEGG富集分析

5.驗(yàn)證了CACNA1d在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，并選擇作為tRF-Val-CAC-016的潛在靶點(diǎn)

研究者引入TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)可能的靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。如圖5a所示，維恩圖取MAPK組與tRF-Val-CAC-016預(yù)測(cè)靶基因的重疊。然后研究者分析了GEO數(shù)據(jù)庫（GSE65801）和TCGA-STAD數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)GSE65801中的CACNA1d、PLA2G4A和TNF(圖5b)，TCGA-STAD中的CACNA1d和PLA2G4A顯著上調(diào)（圖5c）。研究者進(jìn)一步應(yīng)用Kaplan-Meier plotter網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)CACNA1d, TNF, TGFBR1, PDGFC, GADD45B與胃癌預(yù)后顯著且反相關(guān)（圖5d-l）。上述分析提示了CACNA1d作為tRF-Val-CAC-016可能的下游靶點(diǎn)的重要作用。隨后，研究者獲得了90對(duì)GC標(biāo)本的組織微陣列（tissue microarray, TMA），包括詳細(xì)的隨訪數(shù)據(jù)（圖5m）。IHC結(jié)果見圖5n。通過對(duì)隨訪數(shù)據(jù)的分析，研究者發(fā)現(xiàn)CACNA1d的表達(dá)與胃癌的預(yù)后無關(guān)（p=0.1805，圖5o）。GC和NATs的代表性IHC圖像示于圖5p中。CACNA1d在胃癌組織中的蛋白水平顯著上調(diào)（圖5q）。綜合分析結(jié)果取交集，選擇CACNA1d作為靶基因。為了驗(yàn)證CACNA1d的表達(dá)和功能，研究者購買了針對(duì)CACNA1d的siRNA，并選擇si-CACNA1d-1作為相比si-CACNA1d-2和si-CACNA1d-3抑制效果更好的siRNA（圖5r）。相反，pcDNA-CACNA1d可顯著增強(qiáng)CACNA1d的表達(dá)（圖5s）。此外，tRF-Val-CAC-016抑制劑能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)si-CACNA1d對(duì)GC細(xì)胞的抑制功能（圖5t）。類似地，pcDNA-CACNA1d對(duì)GC的作用被tRF-Val-CAC-016 mimics部分緩解（圖5u）。

圖5驗(yàn)證CACNA1d在GC組織中被上調(diào)，并選為tRF-Val-CAC-016的潛在靶標(biāo)

6.Argonaute-2可免疫共沉淀tRF-Val-CAC-016, tRF-Val-CAC-016可通過靶向CACNA1d調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖

測(cè)序圖譜闡明了tRF-Val-CAC-016與CACNA1d mRNA之間可能的結(jié)合關(guān)系（圖6a）， tRF-Val-CAC-016模擬物可以顯著降低RT-PCR中CACNA1d的表達(dá)（圖6b）。tRF-Val-CAC-016模擬物可降低CACNA1d的蛋白水平，tRF-Val-CAC-016抑制劑可促進(jìn)CACNA1d的蛋白水平（圖6c）。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)WT-CACNA1d -3 ' UTR + tRF-Val-CAC-016 mimics組在雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中與其他組相比，可以顯著降低熒光素酶比率（圖6d）。然后，研究者引入RIP（RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與IgG組相比，tRF-Val-CAC-016被Argonaute-2顯著免疫沉淀（圖6e）。凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證了RIP檢測(cè)的PCR產(chǎn)物（圖6f）。此外，免疫印跡證實(shí)了清洗磁珠過程的完整性（圖6g）。

圖6tRF-Val-CAC-016被Argonaute-2免疫沉淀，可通過靶向CACNA1d調(diào)節(jié)GC的增殖

7.CACNA1d可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，并可被tRF-Val-CAC-016調(diào)控

挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了tRF-Val-CAC-016和CACNA1d之間的聯(lián)系。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，si-CACNA1d可以顯著降低胃癌細(xì)胞的增殖，tRF-Val-CAC-016抑制劑可以部分恢復(fù)胃癌細(xì)胞的增殖（圖7a-b）。在EdU實(shí)驗(yàn)中，tRF-val-cac016抑制劑可以挽救si-CACNA1d對(duì)細(xì)胞復(fù)制活性的抑制作用（圖7c-d）。有趣的是，si-CACNA1d導(dǎo)致HGC-27細(xì)胞的G1期阻滯，而NCI-N87細(xì)胞的S期阻滯，并且兩者都可以被tRF-Val-CAC-016抑制劑挽救（圖7e-g）。同樣，tRF-Val-CAC-016抑制劑對(duì)si-CACNA1d的挽救作用也在克隆形成實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)（圖7h-i）。si-CACNA1d對(duì)CACNA1d、CyclinD1、CyclinB、c-myc蛋白表達(dá)的抑制作用被tRF-Val-CAC-016抑制劑部分恢復(fù)（圖7j-k）。同樣，對(duì)CACNA1d的功能進(jìn)行反向驗(yàn)證。分別轉(zhuǎn)染pcDNA-CACNA1d和pcDNA-CACNA1d + tRF-Val-CAC-016 mimics。如圖8a-i所示，tRF-Val-CAC-016 mimics可以顯著逆轉(zhuǎn)pcDNA-CACNA1d對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的增強(qiáng)作用。pcDNA-CACNA1d顯著提高了CACNA1d、CyclinD1、CyclinB、c-myc的蛋白水平，而tRF-Val-CAC-016 mimics可降低這一功能（圖8j-k）。

圖7si-CACNA1d抑制GC增殖，可被tRF-Val-CAC-016抑制劑挽救

圖8pcDNA-CACNA1d增強(qiáng)了GC的增殖，并通過tRF-Val-CAC-016模擬物進(jìn)行了調(diào)節(jié)

8.MAPK信號(hào)通路抑制劑（p38 MAPK-IN）可逆轉(zhuǎn)tRF-Val-CAC-016抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

為了證明MAPK信號(hào)通路的作用，研究者使用p38 MAPK-in來挽救tRF-Val-CAC-016抑制劑對(duì)胃癌增殖的增強(qiáng)作用。這表明p38 MAPK-IN能夠部分阻斷該通路的傳導(dǎo)，表現(xiàn)為tRF-Val-CAC-016抑制劑對(duì)胃癌的影響減弱。如圖9a-b所示，在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，tRF-Val-CAC-016抑制劑增強(qiáng)了GC的增殖，p38 MAPK-IN可以部分逆轉(zhuǎn)這一作用。同時(shí)，tRF-Val-CAC-016抑制劑促進(jìn)了細(xì)胞的復(fù)制活性，p38 MAPK-IN也可以降低這種活性（圖9c-d）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期（圖9e-g）和免疫印跡法檢測(cè)CACNA1d、CyclinD1、CyclinB、c-myc（圖9h-i）也發(fā)生了逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。

圖9MAPK信號(hào)通路抑制劑（p38 MAPK-IN）顯著逆轉(zhuǎn)了tRF-Val-CAC-016抑制劑對(duì)GC增殖的增強(qiáng)

9.tRF-Val-CAC-016抑制NCI-N87移植瘤的增殖

皮下移植實(shí)驗(yàn)探討tRF-Val-CAC-016在體內(nèi)的作用。結(jié)果表明，在異種移植物的體重和腫瘤體積方面，tRF-Val-CAC-016降低了小鼠的腫瘤生長能力（圖10a-d）。這些切除腫瘤的PCR結(jié)果顯示，與激動(dòng)劑對(duì)照組和生理鹽水（NS）組相比，tRF-Val-CAC-016激動(dòng)劑顯著抑制了增殖（圖10e），這也發(fā)生在這些小鼠腫瘤的免疫印跡試驗(yàn)中（圖10f）。此外，對(duì)ki-67和CACNA1d的免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)表明，tRF-Val-CAC-016降低了胃癌的增殖能力，進(jìn)一步證實(shí)了CACNA1d蛋白的表達(dá)和定位（圖10g-h）。同時(shí)，免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)也證明了在tRF-Val-CAC-016激動(dòng)劑組中CACNA1d的低表達(dá)（圖10i）。

圖10tRF-Val-CAC-016抑制NCI-N87異種移植物中的腫瘤增殖

10.tRNA衍生物tRF-Val-CAC-016通過靶向CACNA1d調(diào)節(jié)經(jīng)典MAPK信號(hào)通路

如圖11a所示，機(jī)理圖清楚地解釋了tRF-Val-CAC-016對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響模式。在NCI-N87的免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，tRF-Val-CAC-016模擬物抑制CACNA1d（Cav1.3）、ERK、p-ERK和p-p38的表達(dá)。tRF-Val-CAC-016抑制劑增強(qiáng)了CACNA1d（Cav1.3）、ERK、p-JNK、p38、cyclinB、cyclinD1、c-myc的表達(dá)（圖11b）。si-CACNA1d可抑制CACNA1d（Cav1.3）、JNK、p-p38、cyclinD1和c-myc的表達(dá)水平，該作用可被tRF-Val-CAC-016抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖11c）。pcDNA-CACNA1d增加了CACNA1d（Cav1.3）、ERK、p-ERK、p-JNK、p38、p-p38、cyclinB、cyclinD1和c-myc的表達(dá)，這些表達(dá)被tRF-Val-CAC-016模擬物拯救（圖11d）。在HGC-27中，tRF-Val-CAC-016模擬物降低，而tRF-Val-CAC-016抑制劑促進(jìn)了CACNA1d （Cav1.3）、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、cyclinB、cyclinD1、c-myc的蛋白水平（圖11e）。si-CACNA1d下調(diào)CACNA1d（Cav1.3）、ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、cyclinB和cyclinD1，該作用可被tRF-Val-CAC-016抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖11f）。pcDNA-CACNA1d增強(qiáng)CACNA1d（Cav1.3）、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、cyclinB、cyclinD1和c-myc，而tRF-Val-CAC-016 mimics則表現(xiàn)出減弱作用（圖11g）。

圖11tRNA衍生物tRF-Val-CAC-016通過靶向CACNA1d調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路

結(jié)論：

本研究首次闡明了tRF-Val-CAC-016在胃癌中的功能。對(duì)tRF-Val-CAC-016參與機(jī)制的討論在一定程度上較為全面。tRF-Val-CAC-016在胃癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，臨床病理分析顯示其表達(dá)與組織學(xué)類型和腫瘤大小相關(guān)。此外，tRF-Val-CAC-016通過調(diào)節(jié)CACNA1d介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制胃癌的增殖。綜上所述，tRF-Val-CAC-016有望成為胃癌潛在的診斷標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Xu W, Zheng J, Wang X, Zhou B, Chen H, Li G, Yan F. tRF-Val-CAC-016 modulates the transduction of CACNA1d-mediated MAPK signaling pathways to suppress the proliferation of gastric carcinoma. Cell Commun Signal. 2022 May 19;20(1):68. doi: 10.1186/s12964-022-00857-9.