去泛素化酶UCHL3通過Hippo信號通路促進(jìn)間變性甲狀腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移

YAP是Hippo通路的主要關(guān)鍵效應(yīng)因子之一，YAP在間變性甲狀腺癌(ATC)中異常表達(dá)的機(jī)制尚不明確。在這里，我們鑒定了UCHL3是ATC中真正的YAP去泛素化酶。UCHL3以去泛素化活性依賴的方式穩(wěn)定YAP。UCHL3缺失顯著降低ATC進(jìn)展、干細(xì)胞樣和轉(zhuǎn)移，并增加細(xì)胞對化療的敏感性。UCHL3缺失降低ATC中YAP蛋白水平和YAP/TEAD靶基因表達(dá)。UCHL3啟動子分析顯示，TEAD4通過結(jié)合UCHL3啟動子激活UCHL3轉(zhuǎn)錄?？偟膩碚f，我們的研究結(jié)果表明，UCHL3在穩(wěn)定YAP中起著關(guān)鍵作用，進(jìn)而促進(jìn)ATC的腫瘤發(fā)生，這表明UCHL3可能是治療ATC的潛在靶點(diǎn)。本文于2023年2月發(fā)表于“Cell Death & Differentiation”（IF=12.067）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）UCHL3通過去泛素化活性穩(wěn)定YAP

我們之前報道過YAP促進(jìn)ATC細(xì)胞增殖。我們利用siRNA篩選文庫來鑒定ATC中負(fù)責(zé)YAP去泛素化和穩(wěn)定的去泛素化酶。每種DUBs特異性的四種非重疊siRNA混合物被轉(zhuǎn)染到CAL-62細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)，沉默UCHL3顯著降低了YAP(圖1A)。我們檢測了UCHL3在10種甲狀腺癌細(xì)胞系(TPC-1、B-cpap、IHH4、FTC133、TT、CAL-62、8505c、KHM-5M、8305c、BHT-101)和永久化正常甲狀腺上皮細(xì)胞系(Nthy-ori3-1)中的表達(dá)，我們觀察到ATC細(xì)胞系中UCHL3的表達(dá)有上調(diào)趨勢，尤其是在CAL-62和KHM-5M細(xì)胞中(補(bǔ)充圖)。然后，我們在CAL-62和KHM5M細(xì)胞中敲低UCHL3，進(jìn)一步驗(yàn)證UCHL3在調(diào)節(jié)YAP蛋白水平方面的功能(圖1B)。一致地，UCHL3的異位表達(dá)以劑量依賴的方式深刻上調(diào)YAP。而催化失活的突變體C95A (UCHL3^C95A)失去了上調(diào)YAP的能力，提示UCHL3對YAP的調(diào)控依賴于DUB活性(圖1C)。RT-PCR分析表明，UCHL3沒有改變YAP mRNA的豐度(圖1D)。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，UCHL3的缺失降低了CAL-62細(xì)胞中YAP/TEAD-熒光素酶報告基因的活性(圖1E)。我們檢測了UCHL3參與YAP去泛素化的可能性，并發(fā)現(xiàn)UCHL3缺失會降低YAP蛋白水平，這種影響可以通過添加蛋白酶體抑制劑MG132或過表達(dá)UCHL3-WT來逆轉(zhuǎn)，但其催化失活突變體UCHL3^C95A不能逆轉(zhuǎn)(圖1F, G)。然后，我們用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己亞胺處理細(xì)胞，以確定UCHL3是否會影響YAP的穩(wěn)定性。我們發(fā)現(xiàn)，在UCHL3缺失的細(xì)胞中，YAP的穩(wěn)定性降低(圖1H)。在過表達(dá)UCHL3- WT而非UCHL3^C95A的細(xì)胞中，YAP的半衰期延長(圖1I)。此外，我們觀察到UCHL3和YAP蛋白水平在人甲狀腺癌樣品中呈正相關(guān)(圖1J)。綜上所述，UCHL3通過穩(wěn)定YAP調(diào)控Hippo信號通路。然后我們進(jìn)行免疫熒光檢測評估UCHL3和YAP的細(xì)胞定位。免疫染色結(jié)果表明，YAP和UCHL3同時存在于ATC細(xì)胞的核和細(xì)胞質(zhì)中(圖1K)。我們的免疫共沉淀(CoIP)實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)源性UCHL3可以與內(nèi)源性YAP免疫共沉淀(圖1L)。GST-pulldown實(shí)驗(yàn)表明，UCHL3在體外與YAP相互作用，其相互作用方式不依賴于其DUB活性(圖1M)。此外，缺失分析表明，UCHL3的C端與YAP的WW結(jié)構(gòu)域存在物理相互作用(圖1N-P)。這些發(fā)現(xiàn)表明UCHL3與YAP相互作用。

2）UCHL3去泛素化YAP

由于UCHL3是一種去泛素化酶，我們繼續(xù)研究UCHL3去泛素化YAP的可能性。UCHL3的缺失顯著增加了泛素化-YAP的水平(圖2A)。然后我們進(jìn)行了內(nèi)源性泛素化試驗(yàn)，并檢測了YAP上的內(nèi)源性泛素。如圖2B所示，UCHL3過表達(dá)降低了YAP上的內(nèi)源性泛素。一致地，UCHL3-WT的異位表達(dá)，而不是UCHL3^C95A，在體內(nèi)和體外都顯著降低了細(xì)胞中YAP的泛素化(圖2C, D)。然后，我們用UCHL3的小分子抑制劑TCID處理CAL-62細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與UCHL3 siRNA類似，TCID抑制UCHL3以劑量依賴的方式增強(qiáng)了YAP的泛素化(圖2E)。此外，UCHL3降低了E3連接酶SHARPIN誘導(dǎo)的YAP泛素化(圖2F)。體內(nèi)去泛素化實(shí)驗(yàn)也顯示，UCHL3以時間和劑量依賴的方式去除YAP的泛素鏈(圖2G)。我們進(jìn)一步對一系列泛素突變體進(jìn)行泛素化實(shí)驗(yàn)，以研究UCHL3對YAP的哪一種泛素鏈進(jìn)行了去泛素化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UCHL3有效地去除了YAP上的K11和K48連接的泛素鏈(圖2H)。綜上所述，UCHL3被證明是一種特異性去泛素化酶，其去多泛素化并穩(wěn)定YAP。

3）UCHL3缺失抑制ATC細(xì)胞增殖和遷移

接下來，我們研究了UCHL3在調(diào)節(jié)ATC進(jìn)展中的作用。我們的研究結(jié)果表明，UCHL3的缺失顯著降低了細(xì)胞的增殖和遷移。UCHL3的缺失降低了細(xì)胞增殖，增加了G1期的細(xì)胞數(shù)量，表明UCHL3可能調(diào)節(jié)ATC細(xì)胞從G1到S的轉(zhuǎn)變(圖3A, B)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UCHL3缺失顯著降低了CAL-62和KHM-5M細(xì)胞的克隆形成能力(圖3C)。同樣，EdU摻入實(shí)驗(yàn)表明，UCHL3 siRNA處理的CAL-62和KHM-5M細(xì)胞的DNA合成受到抑制(圖3D, E)。此外，傷口愈合和transwell實(shí)驗(yàn)顯示，UCHL3缺失顯著降低了細(xì)胞遷移能力(圖3F-H)。

4）UCHL3增強(qiáng)間變性甲狀腺癌干細(xì)胞的致瘤能力

由于ATC是一種未分化癌，我們隨后研究了UCHL3在間變性甲狀腺癌干性特征中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，UCHL3缺失顯著減少了CAL-62和KHM-5M細(xì)胞球的形成(圖4A, B)。值得注意的是，與對照細(xì)胞相比，UCHL3的缺失顯著降低了多能轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Nanog、KLF4和Oct4的表達(dá)(圖4C)，并降低了ATC細(xì)胞的ALDH活性(圖4D)。此外，與對照細(xì)胞相比，表達(dá)shUCHL3的CAL-62細(xì)胞在NOD-SCID小鼠中顯示出較弱的腫瘤啟動能力(圖4E)。總的來說，UCHL3的沉默消除了間變甲狀腺癌干細(xì)胞的致瘤能力。

5）增加YAP表達(dá)可以恢復(fù)UCHL3缺失的影響

為了確定UCHL3通過穩(wěn)定YAP調(diào)節(jié)ATC細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制，我們在UCHL3敲除的CAL-62細(xì)胞中進(jìn)行異位表達(dá)YAP或UCHL3^C95A的拯救實(shí)驗(yàn)。CCK8實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)YAP在很大程度上恢復(fù)了CAL-62細(xì)胞的增殖速度(圖5A)。YAP表達(dá)的增加逆轉(zhuǎn)了CAL-62細(xì)胞的克隆形成能力(圖5B)。同樣，過表達(dá)YAP也促進(jìn)了UCHL3缺失的CAL-62細(xì)胞的DNA合成(圖5C)。傷口愈合和transwell實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)YAP在很大程度上逆轉(zhuǎn)了UCHL3缺失誘導(dǎo)的抑制功能(圖5D, E)。但UCHL3^C95A失去了促進(jìn)增殖和遷移的能力。UCHL3的下調(diào)顯著抑制了體內(nèi)腫瘤的生長，而YAP表達(dá)的恢復(fù)則消除了UCHL3缺失引起的抑制(圖5F-H)。我們進(jìn)一步使用尾靜脈注射小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)移評估。UCHL3缺失可顯著抑制小鼠的肺轉(zhuǎn)移，過表達(dá)YAP可緩解這一效應(yīng)(圖5H, I)。綜上所述，這些結(jié)果表明UCHL3通過YAP促進(jìn)ATC進(jìn)展。

6）TCID抑制ATC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移

我們還研究了UCHL3抑制劑TCID (0,5,10 μM)對間變甲狀腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。TCID抑制UCHL3對ATC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移具有劑量依賴性抑制作用(圖6A-E)。此外，我們在體內(nèi)研究了TCID是否影響ATC的生長和轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)TCID治療后裸鼠的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移明顯降低(圖6F-H)。為了進(jìn)一步確定TCID的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用是否由UCHL3和YAP介導(dǎo)，我們構(gòu)建了UCHL3和YAP敲除細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCID對UCHL3和YAP敲除細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移影響極小(補(bǔ)充圖)。符合我們之前的實(shí)驗(yàn)，TCID抑制UCHL3顯著降低ATC細(xì)胞中YAP蛋白質(zhì)水平(圖6I)。環(huán)己酰亞胺和TCID的聯(lián)合更快地減少內(nèi)源性YAP水平(圖6J)。TCID對YAP的作用主要依賴于UCHL3，TCID對UCHL3敲除細(xì)胞中的YAP蛋白水平?jīng)]有影響，UCHL1的缺失不影響YAP蛋白水平(圖6K,6L)。

7）UCHL3通過YAP降低ATC細(xì)胞對化療的反應(yīng)

阿霉素是ATC最常用的化療藥物。YAP活化已被證明在卵巢癌、乳腺癌和肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤的化療耐藥中發(fā)揮作用。我們檢查了抑制UCHL3是否影響細(xì)胞對阿霉素的反應(yīng)。如圖7所示，siRNA或TCID對UCHL3的抑制使CAL-62細(xì)胞對化療藥物的治療敏感(圖7A, B)，而UCHL3缺失所引起的作用可以通過YAP重建來消除(圖7A)。一致地，過表達(dá)WT UCHL3的CAL-62細(xì)胞對阿霉素治療產(chǎn)生耐藥性，而過表達(dá)催化失活的突變體UCHL3的細(xì)胞則沒有這種效果(圖7C)。在KHM-5M細(xì)胞中觀察到同樣的結(jié)果(圖7G,F)。為了在體內(nèi)證實(shí)UCHL3的抗化療功能，將過表達(dá)空載體、UCHL3、YAP或靶向YAP的shRNA的CAL-62細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)。我們發(fā)現(xiàn)，在阿霉素處理后，對照組CAL-62細(xì)胞的腫瘤生長顯著降低，而過表達(dá)UCHL3或YAP的腫瘤細(xì)胞比阿霉素處理的對照組細(xì)胞生長更快，YAP的缺失消除了過表達(dá)UCHL3引起的化療耐藥效應(yīng)(圖7G)。TCID和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用比TCID或阿霉素單獨(dú)應(yīng)用在體內(nèi)顯著抑制腫瘤生長(圖7H)。

結(jié)論：

我們證明了UCHL3是一種YAP去泛素化酶，通過其去泛素化活性穩(wěn)定YAP，促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和腫瘤干性。我們的研究結(jié)果為UCHL3在Hippo信號通路中的作用提供了新的見解，并提示UCHL3可能被證明是治療ATC的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Tang J, Yang Q, Mao C, Xiao D, Liu S, Xiao L, Zhou L, Wu G, Tao Y. The deubiquitinating enzyme UCHL3 promotes anaplastic thyroid cancer progression and metastasis through Hippo signaling pathway. Cell Death Differ. 2023 Feb 22. doi: 10.1038/s41418-023-01134-z.