RNA去甲基化酶ALKBH5通過ITPA m6A修飾促進t(8;21)急性髓系白血病的發(fā)生
染色體平衡易位t（8;21）是急性髓系白血?。?/span>AML）最常見的遺傳畸變之一。即使t（8;21）患者被認為是低危AML，但仍有40~50%的患者接受單獨化療后不可避免地復發(fā)。KIT基因突變似乎是t（8;21）患者最常見的附加基因事件，預后較差。同種異體造血干細胞移植似乎是KIT突變患者的治療方法，然而即使在接受治療后，2年累積復發(fā)率也可接近32%，2年無白血病生存率僅為55%，這表明迫切需要開發(fā)更有效的治療方法來改善患者的預后。該研究發(fā)表于《Biomarker Research》，IF：8.633。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. ALKBH5在T（8;21）AML患者中過表達，是 Kasunmi-1細胞生長所必需的
與正常MNC相比，ALKBH5在mRNA水平上在t（8;21）AML患者中高表達（圖1A）。作者的蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)顯示，ALKBH5在t（8;21）AML患者中的表達明顯更高（圖1B）。同樣，與MNCs相比，Kasumi-5細胞中的ALKBH1蛋白水平更高（圖1C）。此外，基于TCGA-LAML隊列的ALKBH5升高與AML患者的總生存期縮短有關(guān)（圖1D）。
為了研究ALKBH5在t（8;21）AML中的作用，在Kasumi-5細胞中構(gòu)建了敲低ALKBH1細胞模型（圖1E-F）。敲低ALKBH5能實質(zhì)性抑制增殖（圖1G-H）和顯著誘導細胞凋亡（圖1I和L）。敲低ALKBH5也顯著抑制了人原發(fā)性AML細胞的生長（圖1J），并促進人大塊AML細胞的凋亡（圖1K和M）。作者進一步檢測了全局m6A水平并觀察到ALKBH5敲低誘導Kasumi-1細胞和原代細胞中的水平顯著增加（圖1N)。
圖1 ALKBH5是t（8;21）AML細胞生長所必需的
2. 敲低ALKBH5損害（8;21）AML維持
首先，RUNX1-RUNX1T1和套件N822Kmut共表達小鼠用作T（8;21）白血病小鼠模型。為了確定（5;8）AML維持是否需要ALKBH21，作者將ALKBH5 shRNA或?qū)φ?/span>shRNA轉(zhuǎn)導到從 t（8;21）只白血病小鼠收集的t（8;21）白血病BM細胞中，并建立了BMT模型（圖2A）。敲低ALKBH5顯著抑制了體外菌落形成/重鋪試驗檢測到的菌落數(shù)（圖2B）。敲低ALKBH5顯著損害了RUNX1-RUNX1T1和KIT的進展。N822Kmut-在受體小鼠中誘導t（8;21）AML（圖2C）。作者觀察到敲低ALKBH5顯著抑制了轉(zhuǎn)化供體細胞在外周血和BM中的植入（圖2D-E），并減少脾臟和肝臟中白血病細胞的浸潤（圖2F-G）。接下來，作者使用異種移植模型（CDX和PDX）進一步評估ALKBH5在維持人類AML細胞中的潛在作用。正如預期的那樣，敲低ALKBH5顯著延長了異種移植受體小鼠的存活期，并抑制了BM中白血病細胞的植入（圖2H-K）。
圖2 敲低ALKBH5影響小鼠和人類AML的維持
3. 識別t（5;8）AML中ALKBH21的潛在靶標
為了探索 t（5;8）AML中ALKBH21功能的潛在機制，作者對Kasumi-5細胞中的 ALKBH1 敲低進行了轉(zhuǎn)錄組測序。在2326個shALKBH3和5個shNC樣品中鑒定出3個差異表達基因（DEG），包括1533個下調(diào)基因和793個上調(diào)基因（圖3A）。通過GO和KEGG通路富集分析，作者確定了包含凋亡信號通路的前10個GO術(shù)語和前5個KEGG術(shù)語（圖3B-C），這與作者的發(fā)現(xiàn)一致，即敲低ALKBH5增加了Kasumi-1細胞的凋亡。然后，作者使用全局信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)分析確定了關(guān)鍵的DEG（圖3D）。
敲低ALKBH5顯著降低了人AML細胞系、原代AML細胞和鼠RR/KIT AML細胞在兩個轉(zhuǎn)錄處的ITPA水平（圖4A）和蛋白質(zhì)水平（圖4B）。為了研究ITPA作為ALKBH5靶標的功能重要性，作者在操縱ALKBH5和ITPA表達時進行了細胞增殖和克隆形成實驗（圖4C），發(fā)現(xiàn)敲低ALKBH5對細胞生長的抑制作用在很大程度上可以通過ITPA的強制表達來挽救（圖4D-E）。
圖3 Kasumi-1細胞中ALKBH5的潛在靶點鑒定
圖4 ITPA是ALKBH5功能重要的靶點
4. ALKBH5通過改變m6A修飾調(diào)控ITPA mRNA的穩(wěn)定性
由于ITPA是ALKBH5的陽性靶標，也是增殖能力改變的驅(qū)動因素，作者接下來研究了ALKBH5對ITPA表達的調(diào)控機制。敲低ALKBH5可能會影響mRNA輸出和RNA代謝，因此作者評估了ITPA mRNA的穩(wěn)定性和亞細胞定位。敲低ALKBH5顯著降低了Kasumi-1細胞中ITPA mRNA的半衰期（圖5A），而似乎不影響ITPA RNA的核保留或輸出（圖5B）。此外，敲低ALKBH5不影響使用熒光素酶報告基因測定測定的ITPA啟動子活性（圖5C）。
為了確定ITPA mRNA是否是ALKBH5的底物，作者使用RNA免疫沉淀（RIP）結(jié)合qPCR測定。結(jié)果表明，與抗IgG抗體相比，抗ALKBH5抗體可以顯著富集ITPA轉(zhuǎn)錄本（圖5D）。此外，作者使用甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）結(jié)合qPCR來確定ITPA m6A ALKBH5敲低后的甲基化水平。與對照組相比，敲低ALKBH5增加了ITPA mRNA的水平（圖5E）。野生型ALKBH5的過表達，但未報道的催化無活性突變體ALKBH5 H204A的過表達能夠恢復ITPA表達（圖5F），表明ALKBH5主要通過其去甲基化活性影響ITPA表達?？傮w而言，作者的RIP-qPCR和基因特異性m6A-qPCR證實ITPA與ALKBH5的強結(jié)合，并且與ALKBH6敲低后AML細胞的m5A豐度顯著增加和預期表達水平變化相關(guān)。
圖5 ALKBH5通過影響ITPA mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控其表達
5. TCF15通過提高其啟動子活性來調(diào)節(jié)ALKBH5表達
為了研究為什么ALKBH5在AML中高表達，作者專注于富含ALKBH5啟動子的轉(zhuǎn)錄因子。作者從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得了ALKBH5啟動子區(qū)，然后通過UCSC跟蹤JASPAR分析鑒定了600個轉(zhuǎn)錄因子（圖6A）。根據(jù)TCGA-LAML數(shù)據(jù)集，作者通過Pearson分析發(fā)現(xiàn)TCF15和NRF1與ALKBH5顯著相關(guān)。作為一種已知的轉(zhuǎn)錄因子，TCF15對于多能性退出、造血干細胞（HSC）靜止和HSC長期自我更新至關(guān)重要。然而，TCF15在AML中的作用尚不清楚。在AML患者中，耐藥和復發(fā)與LSC/LIC的存在有關(guān)。由于Tcf15表達對HSC具有特異性，并且是HSC長期自我更新所必需的，作者推測TCF15是LSC/LIC自我更新所必需的。TCF15在CD34 LSC / LICs中表達，而不是CD34+?散裝AML細胞（圖6B）。此外，與CD5相比，ALKBH34在CD34 LSC / LICs中高表達+?散裝AML細胞（圖6C）。為了確定TCF15是否直接調(diào)控ALKBH5，作者進行了熒光素酶報告基因測定。潛在結(jié)合位點的缺失突變消除了TCF5過表達對ALHBH15啟動子的反式活化（圖6D-E）。TCF15敲低顯著降低了LSC中ALKBH5和ITPA在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上的表達（圖6F-G）。
基于TCGA-LAML隊列，TCF15表達較高的AML患者與較短的OS相關(guān)（圖6H）。6ALKBH5敲低顯著抑制了人類LSC/LICs的集落形成能力（圖6I）。此外，TCF15敲低對細胞生長的抑制作用在很大程度上可以通過ALKBH5的強制表達來挽救（圖6J）?？傮w而言，TCF15/ALKBH5/ITPA軸在t（8;21）AML的進展中起著至關(guān)重要的作用（圖6K）。
圖6 TCF15通過提高ALKBH5的啟動子活性來調(diào)節(jié)其表達
結(jié)論：
該研究發(fā)現(xiàn)TCF15 / ALKBH5 / ITPA軸在AML發(fā)病機制和LSC / LIC維持中起著至關(guān)重要的作用。AML伴 t（8;21）預后良好，大多數(shù)患者進入緩解期，然而，大約一半患者復發(fā)，只有60%患者在診斷后存活超過5年。未來，通過靶向TCF15 / ALKBH5 / ITPA來消除LSC / LICs代表了治療t（8;21）AML患者的有前途的治療策略。
參考文獻：
Li R, Wu X, Xue K, Feng D, Li J, Li J. RNA demethylase ALKBH5 promotes tumorigenesis of t (8;21) acute myeloid leukemia via ITPA m6A modification. Biomark Res. 2023 Mar 10;11(1):30. doi: 10.1186/s40364-023-00464-x.