Science高分——METRNL調(diào)控心肌修復(fù)

心肌梗死后的有效組織修復(fù)需要在不完全定義的免疫細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的指導(dǎo)下，產(chǎn)生強(qiáng)有力的血管生成反應(yīng)，但機(jī)制不明。本研究確定單核細(xì)胞（Mos）和巨噬細(xì)胞（Mphs）衍生的細(xì)胞因子METRNL（meteorin-like）是梗死后血管生成的驅(qū)動(dòng)力和干細(xì)胞因子受體KIT（KIT受體酪氨酸激酶）的高親和力配體。METRNL通過KIT依賴的信號傳導(dǎo)在體外培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細(xì)胞中介導(dǎo)血管生成作用。在心肌梗死的小鼠模型中，METRNL通過選擇性地?cái)U(kuò)大梗死邊緣區(qū)表達(dá)KIT的內(nèi)皮細(xì)胞群來促進(jìn)梗死修復(fù)。Metrnl缺失的小鼠不能產(chǎn)生這種KIT依賴性的血管生成反應(yīng)，并在梗死后出現(xiàn)嚴(yán)重的心力衰竭。本研究表明，METRNL是缺血組織修復(fù)中的KIT受體配體。本文于2022年6月發(fā)表在《Science》IF：63.714期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、髓細(xì)胞來源的METRNL促進(jìn)心肌梗死后血管生成

作者在急性心肌梗死小鼠模型中進(jìn)行了生物信息學(xué)分泌組分析，發(fā)現(xiàn)了此前未鑒定到的驅(qū)動(dòng)梗死修復(fù)的骨髓細(xì)胞來源的生長因子，即METRNL（meteorin-like），其在左心室梗死區(qū)域的髓系細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)（附圖1）。在假手術(shù)的基線條件下，METRNL在心臟中表達(dá)較弱，但在心肌梗死后強(qiáng)烈表達(dá)。共聚焦顯微鏡顯示，表達(dá)METRNL的細(xì)胞共表達(dá)髓系細(xì)胞標(biāo)志物CD11b，并且定位于梗死邊緣區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞附近（圖1A）。RT-qPCR顯示單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是梗死區(qū)域，骨髓，脾臟和外周血中主要的METRNL表達(dá)的細(xì)胞（附圖2A）。Metrnl廣泛表達(dá)于梗死心臟單細(xì)胞RNA測序確定的Mo和Mph簇中（附圖2B）。根據(jù)CCR2和CX3CR1的表達(dá)來劃分Mos和Mpsh亞群，發(fā)現(xiàn)METRNL在CCR2high的Mos和CCR2highCX3CR1high/low的Mphs中比在CCR2lowCX3CR1high的Mphs中表達(dá)更強(qiáng)（附圖2C）。

隨后用Metrnl缺陷（Metrnl-/-）小鼠建立急性心肌梗死模型，探討Metrnl在梗死修復(fù)過程中的功能。結(jié)果顯示，梗死后敲除小鼠表現(xiàn)出更大的梗死瘢痕，伴有更明顯的左室擴(kuò)張和收縮功能障礙，并且梗死邊緣區(qū)新生毛細(xì)血管形成受損（圖1B）。在基線條件下（圖1B），Metrnl-/-小鼠的心肌毛細(xì)血管密度并未降低，這表明Metrnl缺失特異性地?fù)p害了缺血損傷后的血管生成。

用WT骨髓細(xì)胞移植Metrnl-/-小鼠可逆轉(zhuǎn)血管生成缺陷（圖1C），并改善心肌梗死后的LV瘢痕和重塑。相反，用Metrnl-/-骨髓細(xì)胞移植WT小鼠或通過Metrnlfl/fl小鼠與LysMCre/+小鼠雜交選擇性地刪除骨髓細(xì)胞中的Metrn損害了梗死后的血管生成（圖1C和D）并使LV瘢痕和重塑惡化。這些發(fā)現(xiàn)表明，骨髓細(xì)胞衍生的METRNL能促進(jìn)血管生成、組織修復(fù)和心梗后的功能適應(yīng)。

附圖1生物信息學(xué)骨髓細(xì)胞分泌組篩選

圖1 髓細(xì)胞來源的METRNL促進(jìn)心肌梗死后血管生成

附圖2 心肌梗死后不同細(xì)胞類型Metrnl mRNA的表達(dá)

2、METRNL與KIT的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合

METRNL劑量依賴性地劃痕損傷后的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）增殖和遷移（圖2A-B，上），表明METRNL蛋白直接作用于ECs。使用化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜法，確定KIT是內(nèi)皮細(xì)胞中METRNL細(xì)胞表面受體的候選分子。HEK-293細(xì)胞的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了METRNL和KIT的結(jié)合。為評估METRNL是否與KIT的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從HEK-293細(xì)胞中制備表達(dá)METRNL、SCF、VEGFA，和/或分泌型KIT胞外結(jié)構(gòu)域-Fc片段融合蛋白（KIT-ECD - Fc）的條件上清。從上清液中提取KIT-ECD-Fc，純化了METRNL和SCF，但沒有純化VEGFA（圖2A，下）。微尺度熱泳動(dòng)顯示，METRNL和SCF以相似的高親和力結(jié)合KIT的胞外結(jié)構(gòu)域（圖2B，下）。

圖2 METRNL與KIT的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合

3、上皮細(xì)胞中METRNL和SCF信號通路通過KIT

SCF刺激可誘導(dǎo)受體近膜區(qū)酪氨酸殘基568和570 (Y568/Y570)的KIT同二聚體化和轉(zhuǎn)磷酸化，從而為SRC家族激酶創(chuàng)造一個(gè)對接位點(diǎn)。用METRNL或SCF誘導(dǎo)的KIT (Y568/Y570)磷酸化以相似的動(dòng)力學(xué)處理HCAECs（圖3A，上）。在培養(yǎng)基中加入重組KIT-ECD-Fc可阻止METRNL和SCF誘導(dǎo)KIT (Y568/Y570)磷酸化（圖3A，下），這與跨膜KIT和KIT- ECD - Fc競爭與METRNL和SCF結(jié)合的觀點(diǎn)一致。事實(shí)上，重組KIT-ECD-Fc劑量依賴性地抑制了METRNL和SCF的血管生成作用，但對VEGFA的抑制作用不明顯（圖3B，下）。

KIT下游，METRNL和SCF都誘導(dǎo)SRC(Y416)和AKT1(S473)磷酸化，同樣遵循相似的信號動(dòng)力學(xué)軌跡（圖3B-C，上）。為了獲得更廣闊的視角，應(yīng)用高分辨率質(zhì)譜檢測了METRNL、SCF或VEGFA刺激的HCAECs中的蛋白磷酸化動(dòng)力學(xué)。在基于分布于1891個(gè)不同蛋白質(zhì)的4750個(gè)磷酸化位點(diǎn)的主成分分析中，METRNL和SCF的磷酸化蛋白質(zhì)組標(biāo)簽聚在一起，并在主成分空間中與VEGFA的磷酸化蛋白質(zhì)組標(biāo)簽分離（圖3C，下）。因此，METRNL和SCF的血管生成作用是通過KIT和共享的下游信號通路介導(dǎo)的。

圖3上皮細(xì)胞中METRNL和SCF信號通路通過KIT

4、心肌梗死后，METRNL增加表達(dá)KIT的上皮細(xì)胞群

使用單細(xì)胞RNA測序在成年小鼠心肌中鑒定表達(dá)kit的內(nèi)皮細(xì)胞。雖然在基礎(chǔ)條件下，少數(shù)分散在幾個(gè)EC簇的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Kit，但在MI后，表達(dá)Kit的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4A）。為探討KIT表達(dá)是否會(huì)影響EC對METRNL和SCF刺激的敏感性，從c-kit H2B-tdTomato/+小鼠分離心臟內(nèi)皮細(xì)胞。這些小鼠的細(xì)胞核tdTomato信號完全重現(xiàn)了內(nèi)源性KIT的表達(dá)模式。為調(diào)查KIT在梗死邊緣區(qū)的表達(dá)EC行為，用c-kit H2B-tdTomato/+小鼠構(gòu)建急性心肌梗死模型。正如單細(xì)胞RNA測序觀察到的，在基線條件下和心肌梗死后，c-kit H2B-tdTomato陰性的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量超過c-kit H2B-tdTomato陽性的內(nèi)皮細(xì)胞（圖4B）。然而，兩個(gè)人群的擴(kuò)張對梗死邊緣區(qū)的毛細(xì)血管密度增加的貢獻(xiàn)大致相同（圖4B）。

與METRNL不同，SCF由梗死區(qū)域的ECs、成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞表達(dá)（附圖3A），并且MI后SCF的表達(dá)沒有增加（附圖3B）。此外，在Metrnl- / -小鼠的梗死區(qū)域未觀察到SCF上調(diào)（附圖3C）。為研究METRNL是否驅(qū)動(dòng)KIT在心肌梗死后EC中的表達(dá)，將c-kit H2B-tdTomato等位基因交叉到METRNL- / -小鼠中。在基線條件下，Metrnl缺失不影響c-kit H2B-tdTomato陽性或陰性的心肌EC密度（圖4C）。這表明在發(fā)育過程中，METRNL對于建立細(xì)胞群都不是必需的。然而，心肌梗死后，Metrnl- / -小鼠的c-kit H2B-tdTomato陽性的EC數(shù)量沒有增加，而c-kit H2B-tdTomato陰性EC擴(kuò)增不受影響（圖4C）。

圖4心肌梗死后，METRNL增加表達(dá)KIT的上皮細(xì)胞群

附圖3心肌梗死后SCF在心臟的表達(dá)

參考文獻(xiàn)：

RebollMR, Klede S, Taft MH, Cai CL, Field LJ, Lavine KJ, Koenig AL, Fleischauer J, Meyer J, Schambach A, NiessenHW, Kosanke M, van den Heuvel J, Pich A, Bauersachs J, Wu X, Zheng L, Wang Y, Korf-Klingebiel M, Polten F, Wollert KC. Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase. Science. 2022 Jun 17;376(6599):1343-1347. doi: 10.1126/science.abn3027. Epub 2022 Jun 16. PMID: 35709278; PMCID: PMC9838878.