MicroRNA-210在心肌梗死中控制線粒體代謝并保護(hù)心臟功能

盡管最近在急性心肌梗塞（AMI）的治療和患者生存率的改善方面取得了進(jìn)展，但缺血性心臟病仍然是全球死亡的主要原因，也是慢性心力衰竭的主要原因。仍然需要新的心臟保護(hù)策略來減輕AMI的有害影響，并改善冠心病患者的不良心臟重塑和心功能障礙。動物研究表明，microRNA 210（miR-210）是治療缺血性心臟病的潛在療法，以改善心肌梗死小鼠模型中的心臟功能。人體臨床研究表明miR-210是冠狀動脈疾病的生物標(biāo)志物。MiR-210是細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，通過靶向線粒體能量代謝和活性氧（ROS）通量。線粒體除了通過氧化磷酸化是收縮細(xì)胞ATP的主要來源外，還是細(xì)胞ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵來源。在缺血再灌注（IR）的情況下重新編程線粒體代謝和ROS通量是心臟損傷的關(guān)鍵驅(qū)動因素。因此，在IR期間抑制線粒體呼吸鏈和減少線粒體耗氧量可保護(hù)缺血性心臟病。該研究發(fā)表于《Circulation》，IF: 39.918。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. MiR-210缺乏以性別依賴的方式加重IR誘導(dǎo)的雄性小鼠心功能障礙

MiR-210敲除小鼠和其野生型對照C57Bl/6小鼠在2月齡時(shí)通過結(jié)扎冠狀動脈左中前降支30分鐘后再灌注的方法建立在體心臟缺血再灌注模型。未結(jié)扎左冠狀動脈前降支的假手術(shù)動物作為對照組。分別于再灌注4 h和24 h后分離心臟，檢測心臟中miR-210的表達(dá)。如圖1A所示，在WT小鼠的心臟中，miR-210在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著增加，而KO小鼠沒有。在女性和男性基線之間以及在女性和男性IR治療之間沒有發(fā)現(xiàn)miR-210水平的顯著差異。在體內(nèi)IR治療前和治療后6周，通過超聲心動圖評估心功能。如圖1B至1E和圖S1A至S1G所示，在基線和假手術(shù)動物中，miR-210 KO和WT小鼠的超聲心動圖無顯著差異。IR導(dǎo)致雄性WT小鼠室間隔舒張末期、收縮末期、舒張末期左心室后壁厚度、收縮末期左心室后壁厚度、射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)降低，左心室舒張末期內(nèi)徑、收縮末期內(nèi)徑、舒張末期容積、收縮末期容積增加。在雌性WT小鼠中，IR降低EF和FS，增加左室收縮末期內(nèi)徑和收縮末期容積。值得關(guān)注的是，miR-210的缺失揭示了顯著的性別差異，并顯著加重了IR誘導(dǎo)的雄性小鼠心臟功能障礙，而不影響雌性動物。

圖1MiR-210缺陷加重雄性小鼠心肌梗死后的心功能障礙

2. MiR-210模擬物挽救了MiR-210缺乏對ir誘導(dǎo)的心肌梗死和心功能障礙的作用

鑒于miR-210缺陷僅影響雄性小鼠，作者接下來的研究將集中在雄性動物。作者發(fā)現(xiàn)，與野生型對照相比，在急性IR損傷的情況下，miR-210缺乏增加了MI體積，而miR-210模擬物挽救了miR-210缺乏對MI的影響(圖2A和2B)。同樣，miR-210缺陷增強(qiáng)了LV EF和FS的功能障礙，而miR-210模擬物阻斷了miR-210 KO小鼠中過度的功能障礙(圖2C和圖2D)。

圖2MiR-210 mimic對缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌梗死和心功能障礙具有保護(hù)作用

3. MiR-210在急性心臟IR中控制線粒體生物能學(xué)

線粒體是miR-210在細(xì)胞缺氧反應(yīng)中的主要靶點(diǎn)。在缺血再灌注過程中抑制線粒體耗氧量和生物能對缺血性心臟病具有保護(hù)作用。因此，作者研究了miR-210在急性心臟IR中控制線粒體生物能學(xué)的作用。與此同時(shí)，作者進(jìn)行了Seahorse通量分析，以評估離體心肌纖維束的氧消耗率(OCR，氧化磷酸化指數(shù))和乳酸生成(通過細(xì)胞外酸化率(ECAR，糖酵解指數(shù))評估。Seahorse測量的OCR和ECAR的實(shí)時(shí)軌跡和平均數(shù)據(jù)如圖3A和3G所示。在心肌缺血30分鐘和再灌注24小時(shí)后，作者觀察到，與WT動物相比，miR-210 KO小鼠心臟的基礎(chǔ)OCR和最大呼吸能力顯著且可重復(fù)地增加(圖3B和圖3C)。然而，與與質(zhì)子泄漏相關(guān)的OCR顯著增加(圖3E)相比，用于ATP生成的氧使用量顯著減少(圖3D)，從而導(dǎo)致能量生成的耦合效率顯著降低(圖3F)。與此同時(shí)，作者觀察到miR-210 KO小鼠的基礎(chǔ)ECAR和糖酵解能力降低(圖3H和3I)。miR-210缺陷對心臟線粒體生物能學(xué)的這些影響可通過miR-210模擬物恢復(fù)(圖3A-3I)。這些發(fā)現(xiàn)明確表明miR-210促進(jìn)線粒體代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，從而微調(diào)心臟對急性IR和MI的反應(yīng)。

4. MiR-210在急性心臟IR損傷和心功能障礙中抑制線粒體ROS

在心臟缺血再灌注的情況下，miR-210可能作為一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制來抑制線粒體生物能學(xué)和氧消耗，緩解電子傳遞和氧濃度的不匹配，并降低線粒體ROS (mtROS)通量。接下來，作者使用miR-210模擬物和miR-210 KO小鼠，通過功能獲得和功能喪失的方法，研究了miR-210在IR期間調(diào)節(jié)心臟mtROS生成中的機(jī)制聯(lián)系。MiR-210 KO和WT對照組小鼠采用缺血30 min再灌注24 h的方法，采用mtROS特異性熒光探針MitoSOX.20檢測心臟線粒體來源的ROS作者發(fā)現(xiàn)，在IR處理前1小時(shí)靜脈注射miR-210模擬物可阻斷KO小鼠心臟中mtROS的增加(圖4A)。與此一致，作者觀察到，在IR處理前15分鐘靜脈給予線粒體特異性抗氧化劑MitoQ (4 mg/kg)降低了WT小鼠心臟中的mtROS，并否定了miR-210 KO小鼠中增加的mtROS(圖4B)。然后，作者研究了MitoQ是否以及在多大程度上可以恢復(fù)miR-210缺陷對ir誘導(dǎo)的心肌梗死和心功能障礙的影響。作者發(fā)現(xiàn)，MitoQ減少了WT小鼠中IR誘導(dǎo)的MI，并否定了miR-210缺陷對IR介導(dǎo)的MI的影響(圖4C和4D)。與此同時(shí)，作者觀察到，在IR后3天的miR-210 KO小鼠中，MitoQ挽救了miR-210缺乏對LV EF和FS過度功能障礙的影響(圖4E和4F)。

圖4MiR-210抑制線粒體ROS在急性心臟缺血再灌注損傷和心功能障礙中發(fā)揮作用

接下來，作者檢測了通過MitoQ抑制mtROS的產(chǎn)生對WT和miR-210 KO小鼠心臟線粒體呼吸和糖酵解的影響。作者觀察到，在急性IR環(huán)境下，MitoQ對WT小鼠的基礎(chǔ)線粒體OCR和最大呼吸能力沒有顯著影響，但阻斷了miR-210缺陷對線粒體OCR的影響(圖5B和圖5C)。在WT動物的心臟中，MitoQ顯著增加了用于ATP生成的氧使用量，降低了與質(zhì)子泄漏相關(guān)的OCR，并消除了miR-210缺乏的影響(圖5D和5E)。與此同時(shí)，盡管MitoQ抑制了線粒體呼吸，但它顯著提高了能量產(chǎn)生的耦合效率(圖5F)。此外，作者發(fā)現(xiàn)MitoQ降低了WT小鼠的基礎(chǔ)ECAR和糖酵解能力，并否定了miR-210缺乏對急性IR環(huán)境下心臟糖酵解的影響(圖5H和5I)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明MitoQ的保護(hù)作用是通過其對急性IR時(shí)心臟線粒體呼吸和mtROS生成的影響以及對糖酵解應(yīng)激的釋放來介導(dǎo)的。

圖5MitoQ挽救了miR-210缺乏對線粒體生物能學(xué)的影響

5. GPD2是miR-210控制心肌細(xì)胞mtROS的一個(gè)新靶點(diǎn)

作者首先研究了miR-210靶向GPD2轉(zhuǎn)錄本3 ' -非翻譯區(qū)(3 ' -UTR)的作用。圖6A描繪了miR-210靶向位點(diǎn)的GPD2 3 ' -UTR序列，以及miR-210沉默GPD2 mRNA翻譯的示意圖。作者使用序列對比程序MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)在GPD2 3 ' -UTR中確定了一個(gè)潛在的miR-210互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并使用rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合物免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明，與陰性對照處理的細(xì)胞相比，在miR-210模擬物轉(zhuǎn)染的小鼠新生心肌細(xì)胞中，GPD2 3 ' -UTR富集約5倍(圖6B)，這表明GPD2是miR-210的直接靶點(diǎn)。然后，作者在體外氧糖剝奪(OGD)模型中評估GPD2在miR -210介導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用。作者首先證實(shí)，1% O2 OGD 2小時(shí)和復(fù)氧24小時(shí)顯著上調(diào)心肌細(xì)胞中miR-210的水平，這一上調(diào)被miR-210 LNA(圖6C)。作者發(fā)現(xiàn)，在ogd處理的心肌細(xì)胞中，miR-210 LNA抑制miR-210可上調(diào)GPD2蛋白豐度，而GPD2小干擾RNA處理可逆轉(zhuǎn)這一作用(圖6D)。miR-210 LNA顯著增強(qiáng)了OGD/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和乳酸脫氫酶釋放，用小干擾rna敲低GPD2可抵消這一作用(圖6E)，揭示了GPD2下調(diào)在miR-210介導(dǎo)的心肌細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)中的作用。接下來，作者觀察到，與健康對照組相比，miR-210 LNA的存在增加了OGD/復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞的mtROS(圖6F)。作者發(fā)現(xiàn)，敲低GPD2減少了OGD/復(fù)氧誘導(dǎo)的mtROS，并否定了miR-210 LNA對OGD/復(fù)氧介導(dǎo)的mtROS增加的作用(圖6F)。由于GPD2敲低抵消了miR-210抑制對mtROS生成增加和心肌細(xì)胞OGD/復(fù)氧損傷的影響，作者隨后研究了GPD2敲低對心肌細(xì)胞線粒體呼吸和糖酵解的影響。作者觀察到，在暴露于OGD/復(fù)氧的心肌細(xì)胞中，GPD2敲低對非線粒體呼吸和備用呼吸能力沒有顯著影響(數(shù)據(jù)未顯示)，但阻斷了miR-210抑制對線粒體OCR的影響(圖6G-6I)。此外，在OGD/復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞中，GPD2敲低顯著增加了ATP生成過程中的氧使用，降低了與質(zhì)子泄漏相關(guān)的OCR，提高了線粒體能量生成的偶聯(lián)效率，并抵消了miR-210 LNA誘導(dǎo)的效應(yīng)(圖6J-6L)。同樣，作者發(fā)現(xiàn)GPD2敲低降低了OGD/復(fù)氧心肌細(xì)胞的糖酵解和糖酵解能力，并抵消了miR-210抑制的作用(圖6M-6O)。

圖6 MiR-210靶向GPD2抑制線粒體生物能學(xué)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞缺氧損傷

接下來，作者研究了MitoQ對心肌細(xì)胞缺氧損傷中miR210-GPD2-mtROS信號通路的線粒體的具體作用。作者發(fā)現(xiàn)，在ogd處理的心肌細(xì)胞中，用miR-210 LNA抑制miR-210顯著增加了線粒體中的ROS，這一過程被MitoQ特異性阻斷(圖7A和7B)。與之相對應(yīng)，MitoQ否定了miR-210 lna介導(dǎo)的OGD/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷增加(圖7C)，揭示了心肌細(xì)胞中miR-210信號通路中MitoQ作用于mtROS的機(jī)制聯(lián)系。鑒于miR-210 LNA在ogd處理的心肌細(xì)胞中上調(diào)GPD2蛋白豐度，作者隨后評估GPD2過表達(dá)對心肌細(xì)胞mtROS的具體影響。作者觀察到，與miR-210 LNA類似，GPD2過表達(dá)增加了OGD/復(fù)氧誘導(dǎo)的線粒體和心肌細(xì)胞損傷中的ROS，這一過程被MitoQ阻斷(圖7D-7F)。此外，作者發(fā)現(xiàn)在OGD/復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞中，GPD2過表達(dá)增強(qiáng)了線粒體OCR，降低了ATP生成的氧耗量，增加了與質(zhì)子泄漏相關(guān)的OCR，降低了線粒體能量生成的偶聯(lián)效率，并降低了糖酵解和糖酵解能力。重要的是，MitoQ消除了GPD2過表達(dá)誘導(dǎo)的效應(yīng)(圖S8)。因此，功能缺失和功能獲得的研究結(jié)果提供了明確的證據(jù)，表明GPD2在miR-210對心肌細(xì)胞mtROS生成的影響中起關(guān)鍵作用。

圖7MitoQ抑制miR-210 LNA和GPD2過表達(dá)誘導(dǎo)的mtROS生成和心肌細(xì)胞缺氧損傷

6. 敲低GPD2保護(hù)心臟并否定miR-210缺乏對IR損傷的影響

然后，作者確定了內(nèi)源性miR-210是否以及在多大程度上調(diào)控心臟中的GPD2。作者發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，miR-210 KO小鼠心臟中GPD2蛋白豐度顯著增加(圖8A)。miR-210 KO小鼠IR后4小時(shí)和24小時(shí)心臟中GPD2的增加分別維持和增強(qiáng)(圖8B)。作者在MI中驗(yàn)證了GPD2是miR-210的靶基因，并在缺血30分鐘再灌注24小時(shí)的心臟中證明了內(nèi)源性miR-210與GPD2的3 ' -UTR結(jié)合。在miR-210 mimic轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中，miR-210與GPD2 3 ' -UTR的結(jié)合增加，這與miR-210 mimic轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中miR-210與GPD2 3 ' -UTR的結(jié)合增加一致，IR顯著增加了心臟中miR-210與GPD2 3 ' -UTR的結(jié)合，而這在miR-210 KO小鼠中未觀察到(圖8C)。與此同時(shí)，在IR處理前靜脈給予miR-210模擬物降低了WT小鼠心臟中的GPD2蛋白豐度，并阻斷了miR-210缺乏對急性心臟IR中GPD2蛋白的影響(圖8D)。

在WT和miR-210 KO小鼠中，作者進(jìn)一步確定敲低GPD2是否以及在多大程度上抑制了ir誘導(dǎo)的mtROS生成和MI。作者首先驗(yàn)證了在接受急性IR治療的WT和miR-210 KO小鼠的心臟中，GPD2小干擾rna敲低GPD2蛋白的表達(dá)(圖8E)。然后，作者觀察到，在WT和KO小鼠中，敲低GPD2蛋白豐度降低了ir誘導(dǎo)的mtROS生成和MI，并否定了miR-210缺陷對增加mtROS生成和MI的影響(圖8F-8H)。與此同時(shí)，在心臟中敲低GPD2恢復(fù)了IR后3天miR-210 KO小鼠中觀察到的過度的LV EF和FS功能障礙(圖8I和8J)。

圖8敲低GPD2保護(hù)心臟，并抵消miR-210缺乏對IR損傷的影響

結(jié)論：

該研究在miR-210 KO小鼠中明確證明了內(nèi)源性miR-210在心肌梗死小鼠模型中保護(hù)心臟和改善心功能的作用。功能缺失和功能獲得的研究結(jié)果提供了明確的證據(jù)，表明miR-210在控制線粒體生物能學(xué)和ROS生成方面是必要和充分的，并支持miR-210在心臟IR損傷中保護(hù)心肌細(xì)胞能量的有益作用。該研究確定了GPD2在miR -210介導(dǎo)的心臟mtROS生成調(diào)控中的一個(gè)新的機(jī)制鏈接。該研究還揭示了MitoQ在抑制mtROS和維持線粒體ATP生成方面的復(fù)雜作用，并展示了MitoQ在治療缺血性心臟病和心力衰竭方面的治療潛力。

參考文獻(xiàn)：

Song R, Dasgupta C, Mulder C, Zhang L. MicroRNA-210 Controls Mitochondrial Metabolism and Protects Heart Function in Myocardial Infarction. Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1140-1153.