LncRNA-BC069792靶向KCNQ4抑制乳腺癌腫瘤進(jìn)展
在本研究中，作者探索乳腺癌中lncRNA BC069792的角色，并建立了小鼠模型，開(kāi)展高通量測(cè)序、WB、免疫組化、拯救和突變等實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA BC069792在乳腺癌組織中低水平表達(dá)，在乳腺癌病理分級(jí)高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki-67指數(shù)高的組均顯著降低。而且BC069792抑制體內(nèi)體外乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和代謝。機(jī)制上，BC069792作為分子海綿，吸引hsa-miR-658和hsa-miR-4739，上調(diào)Potassium Voltage-Gated Channel Q4（KCNQ4）的表達(dá)，抑制JAK2和p-AKT活性，在抑制乳腺癌生長(zhǎng)中扮演著重要作用。LncRNA BC069792擔(dān)任乳腺癌中的腫瘤抑制因子，是乳腺癌的一種新的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。本研究于2023年3月1日發(fā)表于《Molecular cancer》，IF：36.3
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
研究采集98例乳腺癌病理，其類型均為原發(fā)性浸潤(rùn)癌和非特異性乳腺癌。作者首先采用RT-qPCR檢測(cè)BC069792在98對(duì)乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示BC069792在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著低于在正常癌組織中的水平，表達(dá)量差異約為4.87倍（圖1a）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，BC069792的表達(dá)能夠區(qū)分乳腺癌組織與正常乳腺組織，曲線下面積為0.9191（圖1b）。這提示BC069792可作為乳腺癌的分子標(biāo)志物。
2、BC069792的定位和穩(wěn)定性
以GAPDH為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參，以U6為細(xì)胞核內(nèi)參的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞系中BC069792約27.6%位于細(xì)胞質(zhì)中。在MDA-MB-468細(xì)胞系中，約26.4%的BC069792在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，73.6%的BC069792在細(xì)胞核中表達(dá)，說(shuō)明BC069792在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有作用（圖1c）。此外，RNA-FISH實(shí)驗(yàn)也顯示BC069792分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中（圖1d）。
為檢測(cè)BC069792的穩(wěn)定性，作者在MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中進(jìn)行放線菌素D給藥實(shí)驗(yàn)。BC069792的內(nèi)容在細(xì)胞檢測(cè)到RT-qPCR給藥后 0 h, 0.5 h, 1 h, 4 h, 8 h和12小時(shí)。結(jié)果表明，與C-MYC相比，BC069792在MDAMB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中穩(wěn)定存在較長(zhǎng)時(shí)間（圖1e）。
圖1 BC069792在乳腺癌組織中的表達(dá)
3、BC069792在體外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力
BC069792與臨床病理參數(shù)的關(guān)系提示BC069792在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。為闡明BC069792在乳腺癌中的特異功能，作者在體外進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)BC069792能顯著抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的增殖（圖2a-b）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BC069792過(guò)表達(dá)細(xì)胞穿過(guò)基底膜的數(shù)量顯著減少（圖2c），BC069792過(guò)表達(dá)顯著抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468的遷移和侵襲能力。
圖2 BC069792抑制乳腺癌細(xì)胞增殖能力
4、BC069792抑制體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力
通過(guò)皮下注射慢病毒LV-BC069792和LV-NC感染MDAMB-231細(xì)胞，建立裸鼠皮下腫瘤模型。5周后，LV-BC069792組的6只裸鼠中有5只檢測(cè)到腫瘤，LV-NC組的6只裸鼠全部發(fā)現(xiàn)腫瘤（圖3a）。腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示，LV-NC組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯高于LV-BC069792組（圖3b），且LV-BC069792組小鼠的腫瘤大小明顯小于LV-NC組（圖3c）。從裸鼠腫瘤組織中提取RNA，進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，證實(shí)BC069792在LV-BC069792組的表達(dá)水平明顯高于LV-NC組（圖3d）。LV-BC069792組Ki-67指數(shù)明顯低于LV-NC組（圖3e）。上述結(jié)果表明，BC069792過(guò)表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。
將慢病毒感染的MDA-MB-231細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，建立遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示，LV-BC069792組有3只裸鼠發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。裸鼠肺中位轉(zhuǎn)移瘤數(shù)為2個(gè)，大小較小。LV - NC組有6只裸鼠出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移灶，裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶中位數(shù)為13個(gè)，腫瘤體積較大。RT - PCR結(jié)果顯示，與LV - NC組相比，LV - BC069792組中BC069792的表達(dá)明顯升高（圖3f）。LV - NC組可見(jiàn)腫瘤侵犯肺臟，其中1只裸鼠肝臟粘連于膈肌，膈肌內(nèi)可見(jiàn)乳腺癌轉(zhuǎn)移灶。LV - BC069792組除肺外未發(fā)現(xiàn)其他轉(zhuǎn)移灶。皮下移植瘤模型中，LV - NC組腫瘤浸潤(rùn)脂肪、橫紋肌和皮膚附屬器，而LV - BC069792組腫瘤邊界更清晰，形成假包膜，無(wú)明顯侵襲（圖3i）。裸鼠皮下成瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型證實(shí)BC069792有效抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
圖3 BC069792抑制體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。
5、RNA-Seq分析揭示KCNQ4是BC069792重要的下游靶基因
根據(jù)mRNA表達(dá)水平，測(cè)序結(jié)果中log2差異倍數(shù)大于2倍且p< 0.05，從測(cè)序結(jié)果中篩選出30個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。RT-qPCR結(jié)果顯示，在30個(gè)基因中，KCNQ4在BC069792過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組的表達(dá)差異最大，在MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)量最高（圖4a）。過(guò)表達(dá)BC069792后，KCNQ4蛋白的表達(dá)量也增加（圖4b）。KCNQ4在正常乳腺組織中的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于乳腺癌組織（圖4c-d）。腋窩腫瘤和肺轉(zhuǎn)移，KCNQ4蛋白和mRNA的表達(dá)，LV-BC069792組顯著高于對(duì)照組LV-NC組（圖4e-h）。BC069792的表達(dá)與KCNQ4呈正相關(guān)（圖4i-j）。BC069792可以促進(jìn)KCNQ4 RNA穩(wěn)定性（圖4k）。上述結(jié)果表明，BC069792在乳腺癌中調(diào)控KCNQ4 mRNA和蛋白的表達(dá)，提示BC069792可能通過(guò)促進(jìn)KCNQ4的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌的進(jìn)展。
圖4 KCNQ4是BC069792的下游靶基因。
5、BC069792作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA（ceRNA），通過(guò)吸附miR-658和miR-4739上調(diào)靶基因KCNQ4的表達(dá)
作者用IgG作為對(duì)照進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，內(nèi)源性BC069792和KCNQ4-3'UTR被Ago2抗體特異性富集（圖5a），提示BC069792和KCNQ4可以與細(xì)胞質(zhì)中的特異性miRNA結(jié)合。通過(guò)miRWalk、RegRNA2.0等網(wǎng)站和ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)能夠與BC069792和KCNQ4結(jié)合的靶miRNA，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出乳腺癌和正常乳腺組織中差異表達(dá)的miRNA。在3組交集中發(fā)現(xiàn)3個(gè)促癌miRNA，分別是miR-658、miR-632和miR-4739（圖5b）。將mirGLOBC069792 / pmirGLO– NCmimics或mimics NC與3種miRNAs共轉(zhuǎn)染至MDA - MB - 231和MDA - MB - 468細(xì)胞株，48 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞中熒光素的含量。與對(duì)照組相比，miR - 658和miR - 4739顯著抑制pmirGLO - BC069792熒光素酶的活性（圖5c），而miR - 632無(wú)明顯作用。最后，將miR - 658和miR - 4739的mimics與pmir GLO-KCNQ4 3 ' UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDA - MB - 231和MDA - MB - 468細(xì)胞，48 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光。miR - 658和miR - 4739均能降低pmir GLO-KCNQ4 3 ' UTR雙熒光素酶活性（圖5d）。為證明miR-658或miR-4739與BC069792結(jié)合的特異性KCNQ4，作者在突變結(jié)合位點(diǎn)后再次進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，miR-658和miR-4739在結(jié)合位點(diǎn)突變后，不再能夠降低pmirGLO-BC069792和pmirGLO-KCNQ4 3’UTR的熒光素酶活性（圖5e-f）。在小鼠腋窩腫瘤和肺轉(zhuǎn)移中，LV-BC069792組miR-658和miR-4739的表達(dá)低于LV-NC組（圖5g-j）。上述結(jié)果表明miR-658和miR-4739能夠特異性結(jié)合BC069792和KCNQ4的3'UTR。當(dāng)BC069792和KCNQ4 3'UTR突變刪除miR-658和miR-4739結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，它們不能與miR-658和miR-4739結(jié)合。上述結(jié)果表明，BC069792像海綿一樣吸附miR-658和miR-4739，解除其對(duì)靶基因KCNQ4的抑制，從而上調(diào)KCNQ4的表達(dá)。
圖5 BC069792通過(guò)結(jié)合miR-658和miR-4739上調(diào)KCNQ4
6、BC069792上調(diào)KCNQ4，從而抑制JAK2和AKT磷酸化，抑制乳腺癌進(jìn)展
根據(jù)作者的RNA - Seq數(shù)據(jù)，膽堿能突觸上的BC069792（hsa04725）增加KCNQ4、PIK3R3和AKT的表達(dá)。眾所周知，PI3K / AKT是經(jīng)典的腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。KCNQ4的mRNA表達(dá)與BC069792呈正相關(guān)，與JAK2呈負(fù)相關(guān)；BC069792的蛋白表達(dá)與KCNQ4呈正相關(guān)，與JAK2呈負(fù)相關(guān)（圖6a-b）。在MDA - MB - 231細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)BC069792顯著降低p - AKT的表達(dá)（圖6c）。同組樣本中KCNQ4的蛋白表達(dá)量明顯高于p - AKT（圖6d）。結(jié)合BC069792過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組中KCNQ4和p – AKT WB檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)KCNQ4與p - AKT呈負(fù)相關(guān)（圖6e）。與LV - NC組相比，LV - BC069792組p - AKT表達(dá)明顯降低（圖6f）。上述結(jié)果表明BC069792通過(guò)上調(diào)KCNQ4抑制JAK2蛋白的表達(dá)和AKT蛋白的磷酸化，降低p-AKT的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌的進(jìn)展。
為進(jìn)一步驗(yàn)證BC069792是否通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)吸附hsamiR-658和hsa-miR-4739發(fā)揮生物學(xué)功能，作者進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)BC069792的乳腺癌細(xì)胞增殖能力降低，遷移能力減弱，KCNQ4蛋白表達(dá)水平升高。當(dāng)BC069792與hsa - miR - 658或hsa - miR - 4739同時(shí)過(guò)表達(dá)時(shí)，BC069792對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用被逆轉(zhuǎn)（圖7a-b），升高的KCNQ4蛋白表達(dá)水平降低（圖7c），降低的p - AKT蛋白水平升高（圖7d）。Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)顯示KCNQ4與p-AKT的負(fù)相關(guān)性恢復(fù)（圖7e）。綜和上述結(jié)果，BC069792通過(guò)與miRNA結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能，可作為分子海綿吸附hsa-miR-658或hsa-miR-4739，上調(diào)靶基因KCNQ4蛋白表達(dá)，抑制p-AKT活性，進(jìn)而發(fā)揮抑制乳腺癌的作用。
圖6 KCNQ4調(diào)控的下游效應(yīng)分子為JAK2/p-AKT。
圖7挽救實(shí)驗(yàn)
結(jié)論
LncRNA BC069792在乳腺癌中表達(dá)較低，在高組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki-67指數(shù)組中表達(dá)明顯降低。BC069792通過(guò)BC069792-hsa- miR -658/ miR-4739-KCNQ-JAK2-AKT的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，從而在體內(nèi)、體外抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。
作者首次發(fā)現(xiàn)lncRNA可以靶向鉀通道蛋白誘導(dǎo)AKT磷酸化。在此基礎(chǔ)上，研究鉀通道KCNQ4的作用機(jī)制及其在癌癥中的作用。
圖8 LncRNA BC069792抑制乳腺癌腫瘤進(jìn)展的機(jī)制
參考文獻(xiàn)
Zhang Y, Dong X, Guo X, Li C, Fan Y, Liu P, Yuan D, Ma X, Wang J, Zheng J, Li H, Gao P （2023） LncRNA-BC069792 suppresses tumor progression by targeting KCNQ4 in breast cancer. Mol Cancer;22（1）:41. doi: 10.1186/s12943-023-01747-5. PMID: 36859185; PMCID: PMC9976483.