腦類器官研究專題之腦類器官構(gòu)建

人腦是一個(gè)高度組織的結(jié)構(gòu)，由各種細(xì)胞類型組成，包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管細(xì)胞。模擬人類大腦發(fā)育具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗枰獙?duì)不同的生化和物理事件進(jìn)行協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。類器官（Organoids）是一種基于3D體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)建立的與體內(nèi)組織或器官高度相似的一種模型，能最大程度模擬人體器官，是促進(jìn)個(gè)體疾病研究和個(gè)性化治療的強(qiáng)大系統(tǒng)。人腦類器官是干細(xì)胞衍生的三維培養(yǎng)物，概括了人腦的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)特征，使其成為移植療法的有希望的來源。人類大腦類器官可以表現(xiàn)出漸進(jìn)的神經(jīng)元成熟和功能，以及強(qiáng)大的宿主介導(dǎo)的血管形成。這些發(fā)現(xiàn)為使用腦類器官移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的前景提供了光明。

今天我們講的是腦類器官構(gòu)建的構(gòu)建方法，該結(jié)果刊登在International Journal of Molecular Sciences。該文章主要講述的是3中腦類器官構(gòu)建方法對(duì)于類器官模型的影響，是一篇片十分基礎(chǔ)的研究。

在文章中作者使用了三種方法構(gòu)建腦類器官：（1）衍生于Lancaster, Madeline A et al. “Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.” Nature vol. 501,7467 (2013): 373-9.的方法，這一類器官命名為PC1；（2）衍生于Lancaster, Madeline A et al. “Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.” Nature vol. 501,7467 (2013): 373-9.的方法，這一類器官命名為PC2，該方法應(yīng)用SMAD、GSK3、TGFβ抑制劑和WNT激活劑；（3）衍生于Pa?ca, Anca M et al. “Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.” Nature methods vol. 12,7 (2015): 671-8.的方法，這一類器官命名為PC3，該方法應(yīng)用SMAD抑制劑和EGF和FGF處理。

免疫熒光檢測(cè)和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)方案產(chǎn)生的類器官具有神經(jīng)元祖細(xì)胞和喙神經(jīng)識(shí)別標(biāo)記物以及神經(jīng)元基因的整體表達(dá)，表明在所有條件下都有有效的神經(jīng)外胚層獲取和神經(jīng)發(fā)生，正如預(yù)期的那樣。

所有皮質(zhì)類器官模型都模擬發(fā)育中的胚胎皮層的體內(nèi)細(xì)胞極性和整體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中PC1類器官在長(zhǎng)期基質(zhì)膠嵌入和默認(rèn)非定向條件后在體外顯示出最保守的細(xì)胞極性。如前所述，方案之間的這些差異可能表明Matrigel對(duì)神經(jīng)上皮和細(xì)胞極性的生長(zhǎng)有影響和/或神經(jīng)誘導(dǎo)形態(tài)生成對(duì)神經(jīng)上皮生長(zhǎng)和細(xì)胞極性的影響。

在第50天和第90天觀察到神經(jīng)元標(biāo)志物的廣泛表達(dá)，來自所有方案的類器官中NEUN⁺和MAP2⁺神經(jīng)元的數(shù)量隨時(shí)間增加。參與神經(jīng)元成熟的基因和參與突觸建立的基因的表達(dá)水平同樣以時(shí)間依賴性方式上調(diào)。這些結(jié)果表明，腦類器官顯示出時(shí)間依賴性成熟，神經(jīng)元功能所必需的基因（如AMPA和NMDA受體的亞基以及突觸后密度蛋白）的表達(dá)增加

發(fā)現(xiàn)PC1衍生類器官中TBR3+深層皮質(zhì)神經(jīng)元的比例更高，PC2和PC2衍生類器官中CTIP1+（深層）和SATB3+（上層）神經(jīng)元的比例更高。此外， PC3衍生的類器官在第1天顯示出更高水平的谷氨酸能標(biāo)志物VGLUT1和更高的VGLUT90點(diǎn)密度，表明谷氨酸能同一性更高。還在PC3類器官中檢測(cè)到更高百分比的GAD67+抑制神經(jīng)元。Biomark分析確認(rèn)了這些結(jié)果。端腦、皮質(zhì)和谷氨酸能特異性標(biāo)志物（如 FOXG1、EMX1、TBR2、NEUROD1、TBR1 和 VGLUT1）在3個(gè)月（第90天）在 PC3 來源的類器官中表達(dá)更多。這些數(shù)據(jù)表明，在沒有WNT激活的情況下，引導(dǎo)分化顯示出皮層、谷氨酸能和GABA能抑制性神經(jīng)元祖細(xì)胞的最高富集，這表明在雙重SMAD抑制和沒有WNT活化等尾狀化因子的情況下具有更高的頭側(cè)皮層同一性