CircRNA DICAR——糖尿病心肌細(xì)胞焦亡的新型內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子

研究鑒定一個在糖尿病小鼠心臟中下調(diào)的保守的circRNA（circDICAR）。DICAR對糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）具有抑制作用，DICAR缺陷（DICAR+/-）小鼠表現(xiàn)出自發(fā)性心功能障礙、心肌細(xì)胞肥大和心臟纖維化，而DICAR過表達(dá)（DICARTg）小鼠DCM得到緩解。在細(xì)胞水平，作者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DICAR抑制糖尿病心肌細(xì)胞焦亡，而敲低DICAR增強(qiáng)糖尿病心肌細(xì)胞焦亡。在分子水平上，作者確定DICAR-VCP-Med12降解可能是DICAR介導(dǎo)效應(yīng)的潛在分子機(jī)制。合成的DICAR junction part（DICAR-JP）表現(xiàn)出與整個DICAR類似的結(jié)果。此外，糖尿病患者循環(huán)血細(xì)胞和宣講中DICAR的表達(dá)均低于健康對照組，這與糖尿病心臟中DICAR表達(dá)降低相一致。DICAR和合成的DICAR-JP可能是治療DCM的候選藥物。本研究于2023年3月發(fā)表于期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》上，IF：38.104。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、DICAR與小鼠糖尿病心肌病相關(guān)

作者通過circRNA微陣列篩選野生型（WT）小鼠和糖尿病db/db小鼠心肌組織中circRNA表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人和小鼠之間具有高度同源性的58個circRNAs在兩組之間差異表達(dá)1.5倍以上（P<0.05）（GSE199133）。兩組circRNA芯片代表性結(jié)果見圖1a。選取5個差異表達(dá)倍數(shù)最高的circRNA進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證（圖1b）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mm9_circ_008009是糖尿病心臟中表達(dá)下調(diào)最多的circRNA（圖1b）。mm9_circ_008009抗核糖核酸酶R消化，而線性GAPDH mRNA易被降解（圖1c）。根據(jù)circBase，mm9_circ_008009的親本基因?yàn)門ulp4。mm9_circ_008009由Tulp4的exon1和intron形成（圖1d）。mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202在cDNA中均被擴(kuò)增引物，而在gDNA中均未擴(kuò)增（圖1e-f），表明circRNA種類為環(huán)狀。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序分析，發(fā)現(xiàn)mm9_circ_008009是通過“反向剪接”機(jī)制從Tulp4的外顯子1和內(nèi)含子產(chǎn)生的（圖1g）?；赾ircBase，作者比對mm9_circ_008009與TULP4轉(zhuǎn)錄的36個人類circRNA之間的序列，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0131202與mm9_circ_008009之間的保守性為79.65 %。此外，鑒定hsa_circ_0131202的circRNA特征，在cDNA中用發(fā)散引物檢測到該RNA，但在人心肌細(xì)胞（HCMs）的gDNA中沒有檢測到該RNA（圖1f）。序列分析發(fā)現(xiàn)mm9_circ_008009結(jié)合位點(diǎn)約20 bp的片段與hsa_circ_0131202相似（圖1g-h）。此外，hsa_circ_0131202的RNA模型結(jié)構(gòu)與mm9_circ_008009的RNA模型結(jié)構(gòu)相似（圖1j-i），包含了反向剪接結(jié)（BSJ）。因此，來源相同、結(jié)構(gòu)和序列相似的hsa_circ_0131202和mm9_circ_008009可能具有相同或相似的分子和生物學(xué)功能。熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)（FISH）顯示，mm9_circ_008009主要定位于心臟組織細(xì)胞中（圖1k）。因此，作者將mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202命名為糖尿病誘導(dǎo)循環(huán)相關(guān)circRNAs（DICAR）。

圖1糖尿病性心肌病小鼠中circRNA的表達(dá)

2、DICAR^+/?小鼠表現(xiàn)出心功能障礙、心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化

為測試DICAR在糖尿病性心肌病中的潛在作用，作者創(chuàng)造DICAR敲除小鼠。作者發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比，雜合子DICAR缺陷（DICAR+/-）小鼠的心功能受損。超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，與同齡WT對照小鼠相比，DICAR+/-小鼠左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室舒張末期容積（LVEDV）和左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）增加（圖2a-b）。3月齡時，DICAR+/-小鼠的射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）降低（圖2a-b）。結(jié)果表明，DICAR表達(dá)降低會損害心臟功能，這與糖尿病患者的心臟功能障礙類似。

為檢測DICAR在心臟重塑和纖維化中的潛在作用，作者分析DICAR +/-小鼠的心肌細(xì)胞面積和纖維化面積。與WT小鼠相比，年齡匹配的DICAR+/-小鼠wheat germ agglutinin（WGA）染色顯示心肌細(xì)胞體積明顯增大（圖2c），Masson染色顯示心肌間質(zhì)膠原沉積明顯增加（圖2d），Ⅲ型膠原表達(dá)增強(qiáng)（圖2e），反映心臟重構(gòu)。

為檢測DICAR對細(xì)胞焦亡的影響，作者在DICAR +/-小鼠心臟組織中檢測一組細(xì)胞焦亡相關(guān)的生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)通過檢測cleaved GSDMD、ASC、NLRP3、caspase-1 p21蛋白的表達(dá)來評估細(xì)胞焦亡的激活情況。結(jié)果顯示，與WT對照組相比，DICAR +/-小鼠心臟組織中焦亡的所有蛋白標(biāo)志物均上調(diào)（圖2f）。

圖2 DICAR對心功能及心肌重構(gòu)的影響

3、DICAR^Tg小鼠對糖尿病引起的心臟損傷具有抗性

為進(jìn)一步研究DICAR在DCM發(fā)生發(fā)展中的作用，作者構(gòu)建DICARTg小鼠，用于誘導(dǎo)2型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM），以探究其對DCM的潛在保護(hù)作用。對DICARTg小鼠進(jìn)行超聲心動圖心功能評估。與非糖尿病野生型（WT）組相比，野生型糖尿?。╓T-DM）組左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、FS、SV、LVESV、LVEDV、CO等心功能指標(biāo)均受損?？梢?，糖尿病DICARTg小鼠受損的心功能得到明顯改善（圖3a）。這些數(shù)據(jù)表明DICAR可能是DCM心臟保護(hù)中的關(guān)鍵circRNA。此外，與WT小鼠相比，WGA染色顯示W(wǎng)T-DM小鼠心肌細(xì)胞體積增大，而糖尿病DICARTg小鼠心肌細(xì)胞體積增大被明顯抑制（圖3b）。在Masson染色心肌間質(zhì)膠原沉積模式（圖3c）和免疫組化Ⅲ型膠原表達(dá)模式（圖3d）中，DICAR過表達(dá)也有類似的作用。這些數(shù)據(jù)表明DICAR可能是DCM過程中心臟保護(hù)的關(guān)鍵circRNA。

隨后作者通過GSDMD、NLRP3、caspase-1和ASC的激活來確定心臟組織的焦亡。結(jié)果顯示，與T2DM野生型對照小鼠相比，這些焦亡相關(guān)蛋白在T2DM DICARTg小鼠心臟組織中被顯著抑制（圖3e）。用ADDICAR（adenovirus-expressing DICAR expression）轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞48 h，再用AGEs（200 μg/mL）處理體外培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞48 h，過表達(dá)DICAR。Western blotting結(jié)果顯示，在這些小鼠心肌細(xì)胞中，DICAR過表達(dá)抑制了AGEs對GSDMD、NLRP3、caspase-1和ASC活化的影響（圖3f）。

圖3 DICAR功能的增加改善了DICAR^Tg小鼠T2DM誘導(dǎo)的心功能

4、VCP與DICAR相互作用調(diào)控糖尿病引起的心肌細(xì)胞焦亡

對DICAR的第二個結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在連接結(jié)構(gòu)域中存在一個特異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1I）。由于作者發(fā)現(xiàn)DICAR定位于心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1g），因此作者確定DICAR是否可以與蛋白相互作用并調(diào)控蛋白。染色質(zhì)分離RNA純化-質(zhì)譜（ChIRP-MS）是一種檢測與ncRNA結(jié)合蛋白的方法，用于鑒定DICAR的結(jié)合蛋白。純化DICAR結(jié)合位點(diǎn)的生物素標(biāo)記探針，通過與小鼠心臟組織裂解液孵育進(jìn)行circRNA pull - down實(shí)驗(yàn)，隨后進(jìn)行MS檢測。共檢測到50個蛋白，其中含纈酪肽蛋白（VCP）基于獨(dú)特肽段和序列覆蓋度得分最高。VCP，也被稱為過渡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（tER）ATP酶或p97，是ATP酶家族中豐富且高度保守的成員，與多種細(xì)胞活動（AAA）相關(guān)，可控制泛素-蛋白酶體（Ub-Pr）降解途徑中的關(guān)鍵步驟。平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）進(jìn)一步驗(yàn)證23個DICAR結(jié)合的VCP蛋白，結(jié)果顯示其在db/db小鼠心臟中的表達(dá)抑制高達(dá)31%（圖4a）。但總VCP蛋白表達(dá)量在兩組間無差異（圖4b）。此外，為檢測VCP與DICAR的結(jié)合能力，用VCP抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，然后對DICAR進(jìn)行qPCR。如圖4c所示，通過WB評估IP的特異性，發(fā)現(xiàn)在VCP IP中檢測到獨(dú)特的VCP條帶，而在IgG IP中沒有檢測到。DICAR與VCP的結(jié)合量在DICARTg小鼠心臟中最高，在WT小鼠心臟中居中，在DICAR+/-小鼠心臟中檢測不到。

為進(jìn)一步探索DICAR-VCP結(jié)合模型，作者使用一個完整的基于結(jié)構(gòu)的計算框架Rosetta-Vienna RNP-ΔΔG。如圖4d所示，在對接區(qū)域，DICAR（19 bp）的二級RNA結(jié)構(gòu)通過氫鍵、鹽橋、氨基酸殘基側(cè)鏈網(wǎng)絡(luò)和靜電作用模型（附表S3）與VCP蛋白的氨基酸殘基結(jié)合。此外，為驗(yàn)證DICAR與VCP的結(jié)合親和力，作者合成了19 bp的DICARjunction part（DICAR-JP）。作者通過SPR測定DICAR和VCP之間的動力學(xué)速率常數(shù)。結(jié)果表明，DICAR-JP的結(jié)合常數(shù)（Kd）為5.4×10-9（圖4e）。因此，作者證明DICAR可以通過連接片段與VCP結(jié)合，并且DICAR-JP是DICAR與VCP結(jié)合的關(guān)鍵片段。

為探討DICAR-JP/VCP復(fù)合物在糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡中的作用，本研究體外合成了小鼠DICAR-JP（mDICAR-JP）、人DICAR-JP（hDICAR-JP）和VCP-siRNA。為探究DICAR-JP與VCP的聯(lián)合作用，作者將DICAR-JP與VCP-siRNA共同轉(zhuǎn)染MCMs。如圖4f所示，DICAR-JP抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，VCP-siRNA增強(qiáng)DICAR-JP對細(xì)胞焦亡的抑制作用。因此，位于細(xì)胞質(zhì)中的DICAR-JP/VCP復(fù)合物可能在DCM的細(xì)胞焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖4 VCP與DICAR在AGEs誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡中的相互作用

5、DICAR通過Ub-protein系統(tǒng)調(diào)控VCP介導(dǎo)Med12蛋白降解

為檢測DICAR是否被定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的PE - DICAR探針標(biāo)記，用ER - Tracker Green進(jìn)行FISH檢測（圖5a）。作者還檢驗(yàn)位于ER的VCP的DICAR調(diào)控。與WT組相比，DICAR+/-促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中VCP的表達(dá)，DICARTg抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的VCP（圖5b）。

然而，過表達(dá)DICAR并不能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的VCP水平降低到正常生理條件下的水平。然后，作者檢測DICAR在泛素化蛋白降解過程中是否通過與VCP相互作用介導(dǎo)蛋白的泛素化。在心臟中檢測與VCP結(jié)合的蛋白質(zhì)的泛素化水平。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)DICAR+/-小鼠的蛋白泛素化水平下調(diào)（圖5c）。作者進(jìn)一步證實(shí)DICAR結(jié)合位點(diǎn)的特殊序列是泛素化蛋白的分子伴侶，可以協(xié)助蛋白的泛素化降解。AGEs可下調(diào)DICAR，進(jìn)而促進(jìn)VCP在糖尿病心肌焦亡發(fā)生發(fā)展中的作用。DICAR的連接位點(diǎn)可能作為心肌細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

基于VCP在蛋白降解中的功能及其與DICAR的相互作用，利用LC - MS檢測WT和DICAR+/-小鼠心臟組織的蛋白水平（圖5d）。如圖5d所示，在泛素化過程中有5個蛋白表達(dá)下調(diào)，包括Myom1、Myh6、Med12、Myl2和Cavin2。作者隨后檢測這些蛋白在DICAR+/-小鼠心臟組織中的表達(dá)。如圖5e所示，在這5個蛋白中，Med12是DICAR+/-小鼠心臟中表達(dá)下調(diào)最多的蛋白。為查清Med12 mRNA水平是否也受到調(diào)控，作者在DICAR+/-和DICARTg小鼠模型中檢測了Med12的mRNA。如Fig 5f所示，Med12 mRNA無變化。在T2DM小鼠心臟中檢測到這5個蛋白，其中Med12也是下調(diào)最多的蛋白（圖5g）。結(jié)果提示，DICAR的下調(diào)可能通過Ub-protein降解系統(tǒng)解除VCP對Med12蛋白的降解作用。

Med12在T2DM心臟中表達(dá)降低，而在糖尿病DICARTg小鼠的心臟中表達(dá)上調(diào)（圖5h）。mDICAR逆轉(zhuǎn)了AGEs（200μg/mL, 24 h）對Med12蛋白的下調(diào)作用（圖5i）。然而，與DICAR-JP相比，DICARJP和VCP-siRNA共轉(zhuǎn)染并沒有對逆轉(zhuǎn)的Med12表達(dá)起到更好的作用（圖5i）。這是VCP過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞在探索DICAR-JPblock function的局限性。此外，Med12 siRNA單獨(dú)也可誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞焦亡（圖5j）。

圖5 VCP通過Ub-protein系統(tǒng)介導(dǎo)Med12蛋白降解

6、糖尿病患者外周血單核細(xì)胞和血漿中DICAR水平降低

為了解DICAR表達(dá)與患者糖尿病之間的臨床聯(lián)系，作者測定3組年齡匹配的人外周血單核細(xì)胞（PBMCs）和循環(huán)血漿中的DICAR水平：正常健康對照組、糖尿病（T2DM）伴和不伴心功能不全患者。三組間性別、年齡、HR、BMI、SBP、DBP、Cr、BUN無統(tǒng)計學(xué)差異。糖尿病患者中TG、TC、HG較高（表1）。健康人PBMCs中DICAR水平為1.90±0.34，血漿中DICAR水平為1.22±0.32，糖尿病合并心功能不全患者（PBMCs : 0.84±0.12 ;血漿: 0.88±0.17）和糖尿病無心功能不全患者（PBMCs : 0.39±0.06 ;血漿: 0.57±0.10）中DICAR水平降低（表1）。

參考文獻(xiàn)

Yuan Q, Sun Y, Yang F, Yan D, Shen M, Jin Z, Zhan L, Liu G, Yang L, Zhou Q, Yu Z, Zhou X, Yu Y, Xu Y, Wu Q, Luo J, Hu X, Zhang C. 2023. CircRNA DICAR as a novel endogenous regulator for diabetic cardiomyopathy and diabetic pyroptosis of cardiomyocytes. Signal Transduct Target Ther;8（1）:99. doi: 10.1038/s41392-022-01306-2