tRF-Gln-CTG-026通過減輕整體蛋白合成來改善肝損傷

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2023-05-12
盡管tsRNA在調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和損傷方面發(fā)揮重要作用,但由于缺乏以治療為重點(diǎn)的研究,tsRNA尚未被開發(fā)為減輕疾病的小治療RNA......


肝臟執(zhí)行各種生物學(xué)功能以維持體內(nèi)平衡,如糖原儲存、營養(yǎng)代謝、膽汁分泌和蛋白質(zhì)合成。當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí),肝細(xì)胞會經(jīng)歷巨大的損傷應(yīng)激,導(dǎo)致出血性壞死、肝細(xì)胞凋亡、肝脂肪變性和肝臟炎癥等。由急性肝衰竭、肝硬化、癌癥及其他原因引起的肝損傷是全世界眾多死亡的重要原因。肝移植幾乎是促進(jìn)生存的唯一治療方法,卻受副作用和供體短缺的限制。肝臟可以有效地將小RNA輸送到其中,小RNA療法可能為肝損傷開辟一條新途徑。tsRNAtRNA衍生的小RNA)參與應(yīng)激反應(yīng),并與損傷有廣泛的關(guān)聯(lián)。盡管tsRNA在調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和損傷方面發(fā)揮重要作用,但由于缺乏以治療為重點(diǎn)的研究,tsRNA尚未被開發(fā)為減輕疾病的小治療RNA。該研究發(fā)表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》,IF38.104


技術(shù)路線:



主要研究結(jié)果:

1. 建立NSun2缺失作為tsRNA生成模型以減輕體外損傷

作者首先在小鼠中誘導(dǎo)肝損傷,以驗(yàn)證tsRNA是否參與肝損傷和修復(fù)(圖1a)。作者發(fā)現(xiàn)在肝損傷小鼠中,tsRNA的數(shù)量增加(圖1b),說明tsRNA的產(chǎn)生與肝損傷有關(guān)。為了進(jìn)一步研究tsRNA與肝損傷的關(guān)系,有必要建立tsRNA生成模型。作者首先在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中定義中高、低損傷應(yīng)激的標(biāo)準(zhǔn)。對H2O2HL-7702AML12細(xì)胞進(jìn)行劑量梯度實(shí)驗(yàn)。由此,作者將10μM H2O2應(yīng)激定義為低H2O2應(yīng)激或增殖應(yīng)激,不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡,但會抑制細(xì)胞生長;將HL-7702500μM H2O2應(yīng)激和AML12100μM H2O2應(yīng)激定義為高H2O2應(yīng)激、致死應(yīng)激或生存應(yīng)激。通過篩選HL-2細(xì)胞系中的三種tRNA修飾酶(NSun1Mettl2Dnmt7702),在低損傷應(yīng)激下,與ME-KDMettl2敲低)和DN-KDDnmt1敲低)相比,NSun2敲低(NS-KD)導(dǎo)致增殖增加(圖1c,e);此外,在高應(yīng)激下,NSun2敲低提高了細(xì)胞存活率(圖1de)。為了進(jìn)一步探索NS-KD在細(xì)胞損傷中的作用,作者使用生長曲線實(shí)驗(yàn)測量了在低H2O2應(yīng)激下連續(xù)5天的細(xì)胞增殖。結(jié)果表明,在H2O2處理下,NS-KD促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖1f)。相比之下,作者應(yīng)用了不同的高強(qiáng)度應(yīng)激誘導(dǎo)劑(CCl4、對乙酰氨基酚和油酸混合物)并測量了細(xì)胞存活率。結(jié)果表明,NS-KD改善了細(xì)胞在應(yīng)激損傷下的存活率(圖1gi)。正如預(yù)期的那樣,NS-KD僅在應(yīng)激下起作用。在基礎(chǔ)條件下,NS-KD不影響細(xì)胞增殖(圖1h,i)??傊?,這些結(jié)果表明肝損傷與tsRNA的產(chǎn)生有關(guān),NS-KD促進(jìn)了體外應(yīng)激下的細(xì)胞增殖和存活,但不改變細(xì)胞遷移。


1 NS-KD減輕細(xì)胞損傷


2. NS-KO減輕肝臟損傷

如上所述,NSun2的缺失是一個(gè)合適的研究tsRNA模型,可以提高細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和生存。因此,作者通過CRISPR / Cas9介導(dǎo)的NSun2基因第2外顯子中56 bp缺失產(chǎn)生了NS-KO小鼠(圖2a)。在功能上,作者首先驗(yàn)證了NSun2缺失突變體是否對肝損傷的應(yīng)激有反應(yīng)。在沒有應(yīng)激損傷的情況下,NS-KO沒有引起肝臟形態(tài)和病理生理學(xué)的異常(圖2b),這表明NS-KO和由此產(chǎn)生的tsRNA在沒有應(yīng)激的情況下都沒有發(fā)揮作用。通過腹腔注射CCl4建立短期或長期肝損傷模型(圖2c),作者證明了NS-KO對應(yīng)激損傷有反應(yīng),并減輕了肝損傷。在CCl4單次注射后第3天,肝臟出現(xiàn)壞死和炎癥;第27天,大鼠出現(xiàn)肝纖維化。NS-KO小鼠的壞死程度低于野生型(WT)小鼠(圖2d)。檢測單次或重復(fù)注射CCl4后的血液生化指標(biāo)。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶在CCl4單次注射后第3天達(dá)到最大值,肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重,在CCl4重復(fù)注射后第27天降至正常水平。NS-KO小鼠的所有三項(xiàng)指標(biāo)均低于WT小鼠,這意味著NS-KO小鼠的肝損傷輕微(圖2e,f)。為了研究NSun2缺失如何改善肝損傷,作者通過BrdU摻入和Ki67染色檢測肝細(xì)胞增殖。與WT小鼠相比,作者發(fā)現(xiàn)NS-KO小鼠在肝損傷第3天增殖的肝細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖2g)。作者還使用原位切口末端標(biāo)記法檢測了NSun2缺失如何影響細(xì)胞死亡。結(jié)果提示肝細(xì)胞凋亡在肝損傷后第3天達(dá)到峰值,然后逐漸下降。與WT小鼠相比,NS-KO小鼠中檢測到較少的凋亡肝細(xì)胞,這意味著NSun2的缺失抵抗了細(xì)胞凋亡(圖2h)。在應(yīng)激條件下,促增殖、促生存和抗炎相關(guān)基因的表達(dá)增加,而抗增殖、抗存活和促炎癥相關(guān)基因的表達(dá)被抑制(圖2i)??傊?,作者觀察到在短期和長期肝損傷方面NS-KO小鼠的肝損傷均比WT小鼠輕,這表明NSun2缺失可減輕體內(nèi)肝損傷。


2 NS-KO改善體內(nèi)肝臟壞死、再生和存活


3. NS-KO衍生的小RNA可促進(jìn)細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和存活

作者假設(shè),NS-KO通過NS-KO衍生的小RNA預(yù)防肝損傷。為了驗(yàn)證這一假設(shè),作者首先在HL-7702細(xì)胞系中敲低NSun2基因,將無酶活性的突變型NSun2K190MC271A)轉(zhuǎn)染到HL-7702細(xì)胞系中,并對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性刺激。EdU摻入實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明,只有WT NSun2抑制了NSun2敲低引起的細(xì)胞增殖促進(jìn)(圖3ab,d),而不是NSun2突變體(K190MC271A)。同樣,只有WT NSun2逆轉(zhuǎn)了NS-KD誘導(dǎo)的細(xì)胞活力增加;NSun2突變體則沒有(圖3c,d)。這些結(jié)果表明,NSun2的缺失主要通過tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的缺失促進(jìn)細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和存活。當(dāng)NSun2失去甲基轉(zhuǎn)移酶活性時(shí),tRNA修飾不可避免地減少。在NS-KO細(xì)胞中,tRNA表達(dá)降低(圖3e)。最顯著的變異是tRNA m5U和前面描述的M5C.13兩者在NS-KO樣品中顯著降低(圖3f,g)。

上述結(jié)果表明,NS-KO在減少tRNA m5Um5C修飾的同時(shí),失去了其甲基轉(zhuǎn)移酶活性。然后作者研究了NS-KO衍生的小RNA是否足以改善細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和存活。作者從WTNS-KO小鼠中分離出14-50 nt50-100 nt的肝RNA片段(作為陰性對照)(圖3h)。由于tsRNA的大小總是小于50 nt,作者認(rèn)為14-50 ntRNA是含tsRNARNA,50-100 ntRNA是非tsRNA和陰性對照。作者首先檢測了14-50 nt RNA50-100 nt RNA 在低H2O2應(yīng)激下的增殖差異。EdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示,與WT小鼠的片段相比,NS-KO小鼠的14-50 ntRNA片段轉(zhuǎn)染增加了細(xì)胞增殖(圖3i)。同樣,CCK-8檢測表明,來自NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段增加了損傷后的細(xì)胞存活率,而來自WT小鼠的14-50 nt RNA片段和來自兩種小鼠的50-100 nt RNA片段(圖3j)。因此,NS-KO衍生的14-50 nt RNA片段在促進(jìn)損傷后的細(xì)胞增殖和存活中發(fā)揮重要作用。


3 NS-KO來源的tsRNA可減輕肝損傷


4. tRF-1NS-KO的重要產(chǎn)物

為了全面分析tsRNA的代謝特性,分析WTNS-KO小鼠在不同應(yīng)激損傷后tsRNA的差異,作者首先確定了NSKOmiRNA的數(shù)量沒有明顯改變(WT52.96%,NS-KO 53.12%)。通過tRNA衍生的小RNA測序(tsRNA-seq),作者鑒定了tRFdb數(shù)據(jù)庫中記錄的841個(gè)未記錄的tsRNA104個(gè)已知的tsRNA(圖4a)。然后,作者通過比較來自WTNS-KO小鼠的樣品來分析tsRNA表達(dá),并鑒定出366個(gè)上調(diào)和267個(gè)下調(diào)的tsRNA,表明NS-KO引起的tsRNA上調(diào)多于下調(diào)。有趣的是,NS-KO小鼠中的tsRNA在整個(gè)損傷過程中保持相對較高的水平,而WT小鼠的tsRNAD3達(dá)到峰值(圖4b)。因此,作者假設(shè)在整個(gè)CCl重復(fù)注射期間,第3天是肝細(xì)胞增殖和tsRNA生成最活躍的時(shí)間(圖2g,4b)。這些結(jié)果表明,NSun2缺失增加了NS-KO小鼠的tsRNA,并預(yù)留了足夠的tsRNA來應(yīng)對應(yīng)激損傷,但在WT小鼠中,tsRNA只能在WT D3產(chǎn)生。

在進(jìn)一步分析了WTNS-KO小鼠在肝損傷不同階段的tsRNA景觀后,作者發(fā)現(xiàn)與其他tsRNA相比,NS-KO小鼠中的tRF-1s突然增加。在肝損傷的各個(gè)時(shí)間點(diǎn),NS-KO組的tRF-1s明顯多于WT組,但WT組僅在第3天增加(圖4cd)。對tRF-1s的詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn),tRF-1s的長度主要在14-23 nt之間(圖4d)。一般來說,NSun2表達(dá)缺失后,肝臟主要產(chǎn)生14-23nttRF-1。作者還檢測了tRF-1s的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其在NS-KO小鼠中的表達(dá)高于WT小鼠,而其他類型的tsRNANS-KO小鼠中的表達(dá)低于WT小鼠(圖4e)。同時(shí),基于WTKO以及WT D0WT D3之間的差異,作者確定了68個(gè)可能起作用的tRF-1。因此,作者確定了tRF-1NS-KO中增加,分析了tRF-1的分布,并確定了68個(gè)NS-KO衍生的tRF-1是預(yù)防肝損傷和響應(yīng)應(yīng)激損傷的候選tsRNA。


4 tsRNA-seq顯示了tRF-1WTNS-KO小鼠中的特征


5. 篩選的tRF-1在體外和體內(nèi)挽救肝損傷

如上所述,肝損傷的副產(chǎn)物主要是tRF-1。為了闡明tRF-1s是否可以作為肝損傷的潛在治療方法,作者人工合成了圖4所示的68個(gè)tRF-1。作者用硫代磷酸酯(PS)、2'-O-甲基(2'-OMe)和膽固醇修飾了tRF-1s,以提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率(圖5a)。將人工合成的tRF-1轉(zhuǎn)染HL-7702細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞(PHH),并在體外和體外驗(yàn)證其功能。EdU摻入試驗(yàn)顯示合成的tRF-1s促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖5b)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)tRF-1s后細(xì)胞活力提高(圖5c)。在PHH實(shí)驗(yàn)中,作者也得到了一致的結(jié)果(圖5de)。為了驗(yàn)證修飾的合成tRF-1s在體內(nèi)的功能,作者將tRF-1s靜脈注射到肝損傷小鼠體內(nèi)。注射68個(gè)tRF-1的結(jié)果顯示損傷減少,肝功能改善(圖5F-i)。這些結(jié)果表明,68個(gè)tRF-1s在體外和體內(nèi)加速了受損肝細(xì)胞的恢復(fù)。綜上所述,作者發(fā)現(xiàn)作者篩選出的tG026在體內(nèi)減輕了肝損傷(圖5J,K),而在NS-KOtG026的表達(dá)增加(圖5l,m)。總之,通過篩選,作者確定了tG026可以減輕肝損傷。


5 篩選的tG026促進(jìn)損傷后的細(xì)胞增殖和存活


6. tRF-Gln-CTG-026通過調(diào)節(jié)核糖體組裝減少全球整體蛋白質(zhì)合成

為了探索tG026的潛在機(jī)制,作者進(jìn)行了RNApull-down-LC-MS/MS測定,以篩選與tG026相互作用的蛋白質(zhì)(圖6a)。在尋找與HL-7702AML12細(xì)胞系的tG026共同相互作用的蛋白后,作者選擇了參與Pre-rRNA加工蛋白TSR1同源物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖6b)。作者推測tG026可能調(diào)節(jié)核糖體。通過RNApull-down實(shí)驗(yàn),作者在兩個(gè)細(xì)胞系中驗(yàn)證了TSR1tG026之間的相互作用(圖6c,d)。為了確定tG026如何調(diào)節(jié)核糖體組裝,作者在HL-7702AML12細(xì)胞中過表達(dá)tG026。結(jié)果表明,tG026不改變18S rRNA的表達(dá),但抑制了TSR118S rRNA之間的關(guān)聯(lián)。這表明tG026抑制TSR1與核糖體之間的相互作用,因?yàn)?/span>18S rRNA是核糖體復(fù)合物的重要組成部分(圖6ef)。最后,tG026抑制GPS(圖6g,h)。綜上所述,NSun2缺失會導(dǎo)致tG026的產(chǎn)生。tG026通過抑制TSR118S rRNA之間的關(guān)聯(lián)來緩解GPS,以促進(jìn)肝損傷后的增殖和存活,可以開發(fā)為緩解肝損傷的RNA藥物。


6 tG026通過抑制TSR118S rRNA之間的相互作用來降低GPS


結(jié)論:

該研究利用調(diào)節(jié)GPStRNA降解產(chǎn)物RNA降低了RNA毒性。相關(guān)機(jī)制是通過tG026介導(dǎo)的TSR118S rRNA之間相互作用的破壞,這是由于tG026TSR1的相互作用,阻止了TSR1Pre-40S核糖體之間的關(guān)聯(lián)。這導(dǎo)致核糖體組裝程序的抑制,從而降低GPS。


tG026在肝損傷中的機(jī)制模型圖:



參考文獻(xiàn):

Ying S, Li P, Wang J, et al. tRF-Gln-CTG-026 ameliorates liver injury by alleviating global protein synthesis. Signal Transduct TargetTher. 2023 Apr 3;8(1):144.