tRF-Gln-CTG-026通過減輕整體蛋白合成來改善肝損傷

肝臟執(zhí)行各種生物學(xué)功能以維持體內(nèi)平衡，如糖原儲(chǔ)存、營養(yǎng)代謝、膽汁分泌和蛋白質(zhì)合成。當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷巨大的損傷應(yīng)激，導(dǎo)致出血性壞死、肝細(xì)胞凋亡、肝脂肪變性和肝臟炎癥等。由急性肝衰竭、肝硬化、癌癥及其他原因引起的肝損傷是全世界眾多死亡的重要原因。肝移植幾乎是促進(jìn)生存的唯一治療方法，卻受副作用和供體短缺的限制。肝臟可以有效地將小RNA輸送到其中，小RNA療法可能為肝損傷開辟一條新途徑。tsRNA（tRNA衍生的小RNA）參與應(yīng)激反應(yīng)，并與損傷有廣泛的關(guān)聯(lián)。盡管tsRNA在調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和損傷方面發(fā)揮重要作用，但由于缺乏以治療為重點(diǎn)的研究，tsRNA尚未被開發(fā)為減輕疾病的小治療RNA。該研究發(fā)表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：38.104。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 建立NSun2缺失作為tsRNA生成模型以減輕體外損傷

作者首先在小鼠中誘導(dǎo)肝損傷，以驗(yàn)證tsRNA是否參與肝損傷和修復(fù)（圖1a）。作者發(fā)現(xiàn)在肝損傷小鼠中，tsRNA的數(shù)量增加（圖1b），說明tsRNA的產(chǎn)生與肝損傷有關(guān)。為了進(jìn)一步研究tsRNA與肝損傷的關(guān)系，有必要建立tsRNA生成模型。作者首先在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中定義中高、低損傷應(yīng)激的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)H2O2HL-7702和AML12細(xì)胞進(jìn)行劑量梯度實(shí)驗(yàn)。由此，作者將10μM H2O2應(yīng)激定義為低H2O2應(yīng)激或增殖應(yīng)激，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但會(huì)抑制細(xì)胞生長；將HL-7702的500μM H2O2應(yīng)激和AML12的100μM H2O2應(yīng)激定義為高H2O2應(yīng)激、致死應(yīng)激或生存應(yīng)激。通過篩選HL-2細(xì)胞系中的三種tRNA修飾酶（NSun1，Mettl2和Dnmt7702），在低損傷應(yīng)激下，與ME-KD（Mettl2敲低）和DN-KD（Dnmt1敲低）相比，NSun2敲低（NS-KD）導(dǎo)致增殖增加（圖1c，e）；此外，在高應(yīng)激下，NSun2敲低提高了細(xì)胞存活率（圖1d，e）。為了進(jìn)一步探索NS-KD在細(xì)胞損傷中的作用，作者使用生長曲線實(shí)驗(yàn)測(cè)量了在低H2O2應(yīng)激下連續(xù)5天的細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，在H2O2處理下，NS-KD促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖1f）。相比之下，作者應(yīng)用了不同的高強(qiáng)度應(yīng)激誘導(dǎo)劑（CCl4、對(duì)乙酰氨基酚和油酸混合物）并測(cè)量了細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，NS-KD改善了細(xì)胞在應(yīng)激損傷下的存活率（圖1g，i)。正如預(yù)期的那樣，NS-KD僅在應(yīng)激下起作用。在基礎(chǔ)條件下，NS-KD不影響細(xì)胞增殖（圖1h，i）。總之，這些結(jié)果表明肝損傷與tsRNA的產(chǎn)生有關(guān)，NS-KD促進(jìn)了體外應(yīng)激下的細(xì)胞增殖和存活，但不改變細(xì)胞遷移。

圖1 NS-KD減輕細(xì)胞損傷

2. NS-KO減輕肝臟損傷

如上所述，NSun2的缺失是一個(gè)合適的研究tsRNA模型，可以提高細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和生存。因此，作者通過CRISPR / Cas9介導(dǎo)的NSun2基因第2外顯子中56 bp缺失產(chǎn)生了NS-KO小鼠（圖2a）。在功能上，作者首先驗(yàn)證了NSun2缺失突變體是否對(duì)肝損傷的應(yīng)激有反應(yīng)。在沒有應(yīng)激損傷的情況下，NS-KO沒有引起肝臟形態(tài)和病理生理學(xué)的異常（圖2b），這表明NS-KO和由此產(chǎn)生的tsRNA在沒有應(yīng)激的情況下都沒有發(fā)揮作用。通過腹腔注射CCl4建立短期或長期肝損傷模型（圖2c），作者證明了NS-KO對(duì)應(yīng)激損傷有反應(yīng)，并減輕了肝損傷。在CCl4單次注射后第3天，肝臟出現(xiàn)壞死和炎癥；第27天，大鼠出現(xiàn)肝纖維化。NS-KO小鼠的壞死程度低于野生型（WT）小鼠（圖2d）。檢測(cè)單次或重復(fù)注射CCl4后的血液生化指標(biāo)。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶在CCl4單次注射后第3天達(dá)到最大值，肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，在CCl4重復(fù)注射后第27天降至正常水平。NS-KO小鼠的所有三項(xiàng)指標(biāo)均低于WT小鼠，這意味著NS-KO小鼠的肝損傷輕微（圖2e，f）。為了研究NSun2缺失如何改善肝損傷，作者通過BrdU摻入和Ki67染色檢測(cè)肝細(xì)胞增殖。與WT小鼠相比，作者發(fā)現(xiàn)NS-KO小鼠在肝損傷第3天增殖的肝細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖2g）。作者還使用原位切口末端標(biāo)記法檢測(cè)了NSun2缺失如何影響細(xì)胞死亡。結(jié)果提示肝細(xì)胞凋亡在肝損傷后第3天達(dá)到峰值，然后逐漸下降。與WT小鼠相比，NS-KO小鼠中檢測(cè)到較少的凋亡肝細(xì)胞，這意味著NSun2的缺失抵抗了細(xì)胞凋亡（圖2h）。在應(yīng)激條件下，促增殖、促生存和抗炎相關(guān)基因的表達(dá)增加，而抗增殖、抗存活和促炎癥相關(guān)基因的表達(dá)被抑制（圖2i）?？傊?，作者觀察到在短期和長期肝損傷方面NS-KO小鼠的肝損傷均比WT小鼠輕，這表明NSun2缺失可減輕體內(nèi)肝損傷。

圖2 NS-KO改善體內(nèi)肝臟壞死、再生和存活

3. NS-KO衍生的小RNA可促進(jìn)細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和存活

作者假設(shè)，NS-KO通過NS-KO衍生的小RNA預(yù)防肝損傷。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先在HL-7702細(xì)胞系中敲低NSun2基因，將無酶活性的突變型NSun2（K190M或C271A）轉(zhuǎn)染到HL-7702細(xì)胞系中，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性刺激。EdU摻入實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，只有WT NSun2抑制了NSun2敲低引起的細(xì)胞增殖促進(jìn)（圖3a，b，d），而不是NSun2突變體（K190M或C271A）。同樣，只有WT NSun2逆轉(zhuǎn)了NS-KD誘導(dǎo)的細(xì)胞活力增加；NSun2突變體則沒有（圖3c，d)。這些結(jié)果表明，NSun2的缺失主要通過tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的缺失促進(jìn)細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和存活。當(dāng)NSun2失去甲基轉(zhuǎn)移酶活性時(shí)，tRNA修飾不可避免地減少。在NS-KO細(xì)胞中，tRNA表達(dá)降低（圖3e）。最顯著的變異是tRNA m5U和前面描述的M5C.13兩者在NS-KO樣品中顯著降低（圖3f，g）。

上述結(jié)果表明，NS-KO在減少tRNA m5U和m5C修飾的同時(shí)，失去了其甲基轉(zhuǎn)移酶活性。然后作者研究了NS-KO衍生的小RNA是否足以改善細(xì)胞在應(yīng)激下的增殖和存活。作者從WT和NS-KO小鼠中分離出14-50 nt和50-100 nt的肝RNA片段（作為陰性對(duì)照）（圖3h）。由于tsRNA的大小總是小于50 nt，作者認(rèn)為14-50 nt的RNA是含tsRNA的RNA，50-100 nt的RNA是非tsRNA和陰性對(duì)照。作者首先檢測(cè)了14-50 nt RNA和50-100 nt RNA 在低H2O2應(yīng)激下的增殖差異。EdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示，與WT小鼠的片段相比，NS-KO小鼠的14-50 nt的RNA片段轉(zhuǎn)染增加了細(xì)胞增殖（圖3i）。同樣，CCK-8檢測(cè)表明，來自NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段增加了損傷后的細(xì)胞存活率，而來自WT小鼠的14-50 nt RNA片段和來自兩種小鼠的50-100 nt RNA片段（圖3j）。因此，NS-KO衍生的14-50 nt RNA片段在促進(jìn)損傷后的細(xì)胞增殖和存活中發(fā)揮重要作用。

圖3 NS-KO來源的tsRNA可減輕肝損傷

4. tRF-1是NS-KO的重要產(chǎn)物

為了全面分析tsRNA的代謝特性，分析WT和NS-KO小鼠在不同應(yīng)激損傷后tsRNA的差異，作者首先確定了NSKO對(duì)miRNA的數(shù)量沒有明顯改變（WT52.96%，NS-KO 53.12%）。通過tRNA衍生的小RNA測(cè)序（tsRNA-seq），作者鑒定了tRFdb數(shù)據(jù)庫中記錄的841個(gè)未記錄的tsRNA和104個(gè)已知的tsRNA（圖4a）。然后，作者通過比較來自WT和NS-KO小鼠的樣品來分析tsRNA表達(dá)，并鑒定出366個(gè)上調(diào)和267個(gè)下調(diào)的tsRNA，表明NS-KO引起的tsRNA上調(diào)多于下調(diào)。有趣的是，NS-KO小鼠中的tsRNA在整個(gè)損傷過程中保持相對(duì)較高的水平，而WT小鼠的tsRNA在D3達(dá)到峰值（圖4b）。因此，作者假設(shè)在整個(gè)CCl重復(fù)注射期間，第3天是肝細(xì)胞增殖和tsRNA生成最活躍的時(shí)間（圖2g，4b）。這些結(jié)果表明，NSun2缺失增加了NS-KO小鼠的tsRNA，并預(yù)留了足夠的tsRNA來應(yīng)對(duì)應(yīng)激損傷，但在WT小鼠中，tsRNA只能在WT D3產(chǎn)生。

在進(jìn)一步分析了WT和NS-KO小鼠在肝損傷不同階段的tsRNA景觀后，作者發(fā)現(xiàn)與其他tsRNA相比，NS-KO小鼠中的tRF-1s突然增加。在肝損傷的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NS-KO組的tRF-1s明顯多于WT組，但WT組僅在第3天增加（圖4c，d）。對(duì)tRF-1s的詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，tRF-1s的長度主要在14-23 nt之間（圖4d）。一般來說，NSun2表達(dá)缺失后，肝臟主要產(chǎn)生14-23nt的tRF-1。作者還檢測(cè)了tRF-1s的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在NS-KO小鼠中的表達(dá)高于WT小鼠，而其他類型的tsRNA在NS-KO小鼠中的表達(dá)低于WT小鼠（圖4e）。同時(shí)，基于WT和KO以及WT D0和WT D3之間的差異，作者確定了68個(gè)可能起作用的tRF-1。因此，作者確定了tRF-1在NS-KO中增加，分析了tRF-1的分布，并確定了68個(gè)NS-KO衍生的tRF-1是預(yù)防肝損傷和響應(yīng)應(yīng)激損傷的候選tsRNA。

圖4 tsRNA-seq顯示了tRF-1在WT和NS-KO小鼠中的特征

5. 篩選的tRF-1在體外和體內(nèi)挽救肝損傷

如上所述，肝損傷的副產(chǎn)物主要是tRF-1。為了闡明tRF-1s是否可以作為肝損傷的潛在治療方法，作者人工合成了圖4所示的68個(gè)tRF-1。作者用硫代磷酸酯（PS）、2'-O-甲基（2'-OMe）和膽固醇修飾了tRF-1s，以提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率（圖5a）。將人工合成的tRF-1轉(zhuǎn)染HL-7702細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞（PHH），并在體外和體外驗(yàn)證其功能。EdU摻入試驗(yàn)顯示合成的tRF-1s促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖5b）。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)tRF-1s后細(xì)胞活力提高（圖5c）。在PHH實(shí)驗(yàn)中，作者也得到了一致的結(jié)果（圖5d，e）。為了驗(yàn)證修飾的合成tRF-1s在體內(nèi)的功能，作者將tRF-1s靜脈注射到肝損傷小鼠體內(nèi)。注射68個(gè)tRF-1的結(jié)果顯示損傷減少，肝功能改善（圖5F-i）。這些結(jié)果表明，68個(gè)tRF-1s在體外和體內(nèi)加速了受損肝細(xì)胞的恢復(fù)。綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)作者篩選出的tG026在體內(nèi)減輕了肝損傷（圖5J，K），而在NS-KO后tG026的表達(dá)增加（圖5l，m）?？傊?，通過篩選，作者確定了tG026可以減輕肝損傷。

圖5 篩選的tG026促進(jìn)損傷后的細(xì)胞增殖和存活

6. tRF-Gln-CTG-026通過調(diào)節(jié)核糖體組裝減少全球整體蛋白質(zhì)合成

為了探索tG026的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了RNApull-down-LC-MS/MS測(cè)定，以篩選與tG026相互作用的蛋白質(zhì)（圖6a）。在尋找與HL-7702和AML12細(xì)胞系的tG026共同相互作用的蛋白后，作者選擇了參與Pre-rRNA加工蛋白TSR1同源物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖6b）。作者推測(cè)tG026可能調(diào)節(jié)核糖體。通過RNApull-down實(shí)驗(yàn)，作者在兩個(gè)細(xì)胞系中驗(yàn)證了TSR1和tG026之間的相互作用（圖6c，d）。為了確定tG026如何調(diào)節(jié)核糖體組裝，作者在HL-7702和AML12細(xì)胞中過表達(dá)tG026。結(jié)果表明，tG026不改變18S rRNA的表達(dá)，但抑制了TSR1和18S rRNA之間的關(guān)聯(lián)。這表明tG026抑制TSR1與核糖體之間的相互作用，因?yàn)?/span>18S rRNA是核糖體復(fù)合物的重要組成部分（圖6e，f）。最后，tG026抑制GPS（圖6g，h）。綜上所述，NSun2缺失會(huì)導(dǎo)致tG026的產(chǎn)生。tG026通過抑制TSR1與18S rRNA之間的關(guān)聯(lián)來緩解GPS，以促進(jìn)肝損傷后的增殖和存活，可以開發(fā)為緩解肝損傷的RNA藥物。

圖6 tG026通過抑制TSR1與18S rRNA之間的相互作用來降低GPS

結(jié)論：

該研究利用調(diào)節(jié)GPS的tRNA降解產(chǎn)物RNA降低了RNA毒性。相關(guān)機(jī)制是通過tG026介導(dǎo)的TSR1和18S rRNA之間相互作用的破壞，這是由于tG026與TSR1的相互作用，阻止了TSR1和Pre-40S核糖體之間的關(guān)聯(lián)。這導(dǎo)致核糖體組裝程序的抑制，從而降低GPS。

tG026在肝損傷中的機(jī)制模型圖：

參考文獻(xiàn)：

Ying S, Li P, Wang J, et al. tRF-Gln-CTG-026 ameliorates liver injury by alleviating global protein synthesis. Signal Transduct TargetTher. 2023 Apr 3;8(1):144.