多組學(xué)生信揭示結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的細(xì)胞間互作空間網(wǎng)絡(luò)
肝臟是癌癥最常見的轉(zhuǎn)移部位。肝臟微環(huán)境被改造，以提供有利于結(jié)腸癌細(xì)胞生長的生態(tài)位，但這種改造的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?nèi)圆磺宄?。本文主要研究轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）肝腫瘤微環(huán)境（TME）的細(xì)胞變化特征。作者證明了肝臟中mCRC的特征是TME中巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄改變；巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)支持CRC在肝臟免疫抑制轉(zhuǎn)移生態(tài)位中的生長。這些特征可用于靶向免疫檢查點抵抗的MSS腫瘤。本文于2022年10月發(fā)表在《Clinical Cancer Research》。
技術(shù)路線：
主要實驗結(jié)果：
1、CRC肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞TME的組分特征
如圖1A所示，本研究依賴于三種不同的方法來表征結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移性TME，包括單細(xì)胞測序分析，多維免疫熒光（IF）和反卷積細(xì)胞狀態(tài)驗證。單細(xì)胞測序結(jié)果的降維UMAP揭示大多數(shù)細(xì)胞簇都有來自不同樣本的貢獻(xiàn)（圖1B），表明在聚類過程中沒有明顯的批次效應(yīng)。根據(jù)所建立的特定細(xì)胞類型的標(biāo)記基因的表達(dá)，將細(xì)胞類型進(jìn)行注釋聚類（圖1C-D）。根據(jù)組織樣本的大小，單細(xì)胞測序檢測的細(xì)胞的絕對數(shù)量、類型和比例各不相同（圖1E）。
此外，作者分析了轉(zhuǎn)移性腫瘤上皮細(xì)胞的基因表達(dá)特征，以及腫瘤上皮細(xì)胞中非整倍體與染色體失衡特征，結(jié)果在附圖中。
圖1CRC肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞TME的組分特征
作者在二次聚類分析后檢查了不同樣本中的髓細(xì)胞群（圖2A和2B）。髓細(xì)胞群具有與組織來源相關(guān)的簇。匹配的肝組織具有正常的髓細(xì)胞，存在于多個不同的簇中。匹配的外周血具有正常的單核細(xì)胞，這些單核細(xì)胞與其他巨噬細(xì)胞類型分開聚集，沒有重疊。來自mCRC樣品的巨噬細(xì)胞與匹配的正常肝組織巨噬細(xì)胞和外周單核細(xì)胞分開聚集。具體而言，mCRC巨噬細(xì)胞存在于簇1和簇3中（圖2A和2B）。
隨后，作者確定了哪些基因定義了特定的髓細(xì)胞簇。發(fā)現(xiàn)CD14或FCGR3A（CD16）陽性的PBMC單核細(xì)胞高度表達(dá)S100A家族基因（圖2C）。樹突狀細(xì)胞表達(dá)HLA基因、CD1C、CLEC9A和IDO1等。肝內(nèi)巨噬細(xì)胞包括正常庫普弗細(xì)胞表達(dá)CD5L、MARCO、LIPA、MAF、VCAM1等。還發(fā)現(xiàn)SPP1高表達(dá)的腫瘤相關(guān)巨噬（TAM）細(xì)胞群，這些巨噬細(xì)胞存在于簇1和簇3中（圖2C）。
作者比較了轉(zhuǎn)移性TME巨噬細(xì)胞與正常肝組織中存在的其他巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)特征（圖2D）。SPP1+TAM的APOC1、APOE、TREM2、FN1、LGALS3、FTL、CD9、CTSB等表達(dá)水平升高。
作者應(yīng)用不同的表達(dá)分析方法來確認(rèn)這些重編程TME巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)。使用enrichR程序，對TME巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的基因進(jìn)行了通路分析，以確定它們調(diào)節(jié)的生物學(xué)相關(guān)過程。結(jié)果檢測到與ECM組織和代謝相關(guān)的term顯著富集。不同的代謝途徑也被富集，包括糖脂代謝、葡萄糖代謝和高密度脂蛋白介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運（圖2E）。接下來，量化了泡沫巨噬細(xì)胞和肝硬化疤痕相關(guān)巨噬細(xì)胞的表達(dá)特征。與正常肝巨噬細(xì)胞相比，mCRC巨噬細(xì)胞對這兩種基因特征都有顯著富集（圖2F）。這些結(jié)果與差異基因表達(dá)分析的結(jié)果重疊。
圖2mCRC、正常肝臟和PBMC中的髓細(xì)胞譜系
3、肝臟轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞成分
使用重聚類和批量校正來表征肝臟mCRC微環(huán)境中存在的不同基質(zhì)細(xì)胞。聚類分析顯示，來自mCRC的基質(zhì)細(xì)胞與正常肝臟中的基質(zhì)細(xì)胞分離（圖3A）。在不同的簇中，有三種主要的細(xì)胞類型，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞（HSC；圖3B）。與mCRC相關(guān)的成纖維細(xì)胞存在于簇1和簇4中（圖3B和和3C）。簇1僅包含來自mCRC的成纖維細(xì)胞，并且與正常肝組織的成纖維纖維細(xì)胞明顯分離。這些細(xì)胞的特征是ECM相關(guān)基因，如參與膠原合成相關(guān)基因的表達(dá)升高，POSTN、FN1、MGP等（圖3D）。因此，聚類1具有CAF的屬性。
將一組CAF差異表達(dá)基因與“matrisome（基質(zhì)組）”的成分進(jìn)行了比較，“基質(zhì)組”是指ECM的核心成分?；|(zhì)組包括纖維連接蛋白、膠原、層粘連蛋白、蛋白多糖等，它們與ECM結(jié)構(gòu)及其分泌有關(guān)（圖3E）。CAFs具有基于幾種膠原基因（COL1A1、COL3A1、COL5A1等）、各種ECM糖蛋白（FN1、POSTN、SPARC、THBS1等）和蛋白聚糖（BGN、VCAN等）的差異表達(dá)的基質(zhì)組程序。這些CAFs細(xì)胞還高度表達(dá)ECM調(diào)節(jié)基因，包括MMP11、MMP14、TIMP1、LOXL1和LOXL2，這些基因參與ECM重塑。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)移性TME中的成纖維細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤的ECM表達(dá)特征。
圖3肝臟轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞成分
4、巨噬細(xì)胞和CAFs的互作網(wǎng)絡(luò)影響其細(xì)胞狀態(tài)
作者提供的部分附圖的結(jié)果顯示，對于所有mCRC，來自CD8 T細(xì)胞的結(jié)果和Tregs的存在表明免疫抑制的TME缺乏抗腫瘤活性。并且，CAFs是TME中最多產(chǎn)的信息溝通者，在所有細(xì)胞間相互作用中占前10%，此外，TME成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞影響mCRC中的T細(xì)胞。
作者發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和CAFs通過特定的受體-配體相互作用影響彼此的基因表達(dá)程序。首先，從TME中的細(xì)胞中鑒定了配體，這些配體可以導(dǎo)致mCRC CAFs中基質(zhì)組基因的表達(dá)（圖4A）。排名最高的基因之一是已建立的ECM調(diào)節(jié)基因TGFB1，它來源于NK細(xì)胞，驗證了這種方法。一些配體來源于巨噬細(xì)胞，包括SPP1、IL1B、TNF、MMP9和CCL2。這些配體具有調(diào)節(jié)包括膠原家族在內(nèi)的幾個核心基質(zhì)組基因的靶基因表達(dá)的潛力。巨噬細(xì)胞配體的其他CAF基質(zhì)組靶基因包括MMP2和VEGFA。這一結(jié)果進(jìn)一步支持了上述發(fā)現(xiàn)，即重編程的SPP1+巨噬細(xì)胞狀態(tài)促進(jìn)mCRC TME中的纖維化。此外，CAFs自身表達(dá)了幾種配體，表明存在自分泌信號。這些配體包括AGT、TGFB3、CTGF、CCL2、FGF1、HGF、CXCL12和CSF1。
接下來，檢測哪些配體可以導(dǎo)致重編程巨噬細(xì)胞狀態(tài)，其特征為炎癥纖維化和脂質(zhì)代謝。排名靠前的配體包括FGF1、CSF1、PGF、TGFB3和TIMP1；均來源于CAFs（圖4B）。這些配體可以靶向巨噬細(xì)胞并調(diào)節(jié)SPP1、FN1和APOE的表達(dá)。因此，來自CAFs的配體具有通過配體-受體相互作用重新編程mCRC巨噬細(xì)胞的潛力?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明TME巨噬細(xì)胞和CAFs之間存在信號網(wǎng)絡(luò)。這種細(xì)胞間通訊影響兩種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄表型。
圖4巨噬細(xì)胞和CAFs的互作網(wǎng)絡(luò)影響其細(xì)胞狀態(tài)
5、肝臟中mCRC TME的空間特征
為確定mCRC的空間細(xì)胞特征，使用CODEX多路成像。這種方法在組織切片上使用25 plex抗體panel，從而能夠以單細(xì)胞分辨率進(jìn)行細(xì)胞類型鑒定（圖5A）。這種空間成像使我們能夠提出關(guān)于肝臟mCRC TME中細(xì)胞類型和細(xì)胞鄰近性的具體問題。
圖像經(jīng)過處理后，發(fā)現(xiàn)共有來自15個mCRC的330893個單細(xì)胞。首先使用Harmony算法的低分辨率批量校正聚類對這些細(xì)胞進(jìn)行聚類。細(xì)胞簇有來自不同腫瘤的貢獻(xiàn)，這一結(jié)果表明充分消除了批次效應(yīng)（圖5B）?；诳贵w染色模式，鑒定了腫瘤上皮細(xì)胞、CAFs、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞和Tregs。通過比較相應(yīng)的HE圖像來驗證細(xì)胞類型分配（圖5C和5D）。不同的細(xì)胞類型在mCRC中具有不同的比例（圖5E）。五個樣本同時具有來自腫瘤不同部位的scRNA-seq和CODEX結(jié)果。
在確定了細(xì)胞類型后，作者檢測了表征不同細(xì)胞狀態(tài)的特定標(biāo)志物的表達(dá)。這些標(biāo)記物是從scRNA-seq結(jié)果中鑒定出來的。與其他細(xì)胞類型相比，TME巨噬細(xì)胞具有高表達(dá)的LGALS3；與其他細(xì)胞類型相比，CAFs具有高表達(dá)COL4A1（圖5F-5G）。這些結(jié)果獨立地證實了前面在scRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的LGALS3–high SPP1+巨噬細(xì)胞?？偟膩碚f，這一結(jié)果為scRNA-seq分析提供了額外的支持，該分析確定了巨噬細(xì)胞和CAFs之間的細(xì)胞間通信。
圖5肝臟中mCRC TME的空間特征
6、獨立mCRC數(shù)據(jù)集中CAFs對臨床結(jié)果的影響
為驗證單細(xì)胞測序的發(fā)現(xiàn)，分析了從肝臟切除的93個mCRC的RNA-seq數(shù)據(jù)。值得注意的是，這些腫瘤中96.6%是MSS。因此，腫瘤具有與用于scRNA-seq的隊列相同的基于肝臟的TME特征。使用去卷積方法CIBERSORTx來推斷該數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞譜系部分。生成了每個細(xì)胞譜系的基因特征矩陣，該矩陣來源于腫瘤樣本特異性細(xì)胞，同時排除了正常肝組織和PBMC（圖6A）。該分析包括腫瘤上皮細(xì)胞和TME特異性CAF、SPP1+巨噬細(xì)胞、DC、內(nèi)皮細(xì)胞、CD8 T、CD4 T、Treg、NK、B和漿細(xì)胞。將該特征矩陣應(yīng)用于大量基因表達(dá)數(shù)據(jù)集導(dǎo)致每個樣本的每個譜系的細(xì)胞級分的量化。成功獲得了所有譜系的細(xì)胞分?jǐn)?shù)。因此，腫瘤特異性單細(xì)胞特征可以在獨立的mCRC基因表達(dá)數(shù)據(jù)集中成功地去卷積。作者還評估了CAF豐度對預(yù)后的影響。總生存率不良的CAFs比例顯著較高（圖6B）。因此，以大量CAF為特征的TME表型與較差的臨床結(jié)果有關(guān)。
圖6、獨立mCRC數(shù)據(jù)集中CAFs對臨床結(jié)果的影響
綜上，本研究揭示了mCRC TME的一個新特征，即在肝轉(zhuǎn)移中巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間存在細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)；使用scRNA-seq，確定了這些細(xì)胞之間不同的通信程序，這些程序有可能相互影響它們的細(xì)胞狀態(tài)；這一發(fā)現(xiàn)得到了空間分析的進(jìn)一步支持，空間分析顯示這些細(xì)胞之間的距離非常近；巨噬細(xì)胞成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在含有Tregs的同時促進(jìn)了缺乏抗腫瘤CD8 T細(xì)胞的免疫抑制TME；TME中成纖維細(xì)胞的增加與更差的患者結(jié)局有關(guān)（圖6C）。巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞因此調(diào)節(jié)肝臟轉(zhuǎn)移生態(tài)位，這代表了轉(zhuǎn)移級聯(lián)的“土壤”成分，可以進(jìn)行腫瘤傳播。
參考文獻(xiàn)：
Sathe A, Mason K, Grimes SM, Zhou Z, Lau BT, Bai X, Su A, Tan X, Lee H, Suarez CJ, Nguyen Q, Poultsides G, Zhang NR, Ji HP. Colorectal Cancer Metastases in the Liver Establish Immunosuppressive Spatial Networking between Tumor-Associated SPP1+ Macrophages and Fibroblasts. Clin Cancer Res. 2023 Jan 4;29(1):244-260. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-22-2041.