一個新證據(jù)——可變剪接調(diào)控精子發(fā)生

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2023-06-19
剪接體成分Bud31介導(dǎo)的AS事件在小鼠精子發(fā)生過程中起著重要作用,AS是SSC調(diào)節(jié)哺乳動物雄性生殖細(xì)胞的自我更新和分化所必須的......


可變剪接(AS)在細(xì)胞分化和發(fā)育過程中受到嚴(yán)密調(diào)節(jié)。AS事件在睪丸中普遍存在,但剪接在精子發(fā)生中的調(diào)控仍不清楚。本文發(fā)現(xiàn)剪接體成分Bud31介導(dǎo)的AS事件在小鼠精子發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用。Bud31介導(dǎo)的AS是精原干細(xì)胞(SSC)調(diào)節(jié)哺乳動物雄性生殖細(xì)胞的自我更新和分化所必須的。本實驗采用構(gòu)建生殖細(xì)胞特異性Bud31敲除小鼠,細(xì)胞培養(yǎng),生精細(xì)胞的富集,RT-qPCR,免疫印跡,免疫組化,免疫熒光,HE染色,染色體彌散免疫熒光分析,SMART-seq,可變剪接和剪接效率分析,RIP-Seq,RNA pull-down,熒光素酶檢測,微基因分析的實驗方法。


技術(shù)路線:



主要實驗結(jié)果:

1、生殖細(xì)胞特異性Bud31基因敲除導(dǎo)致雄性完全不育

剪接因子的表達(dá)水平在細(xì)胞分化發(fā)育過程中受到嚴(yán)格調(diào)控。為描述參與精子發(fā)生的剪接因子,作者使用公開RNA-seq數(shù)據(jù)集(E-MTAB-6798)進(jìn)行分析,在小鼠精子發(fā)生的不同階段的睪丸中鑒定到134個已知剪接因子。其中10個剪接因子在出生后才開始表達(dá),這是精原細(xì)胞增殖開始的時候(圖1A)。同時,使用E-MTAB-6798分析AS事件,發(fā)現(xiàn)AS事件在P3時顯著增加,與P0相比,在P28時達(dá)到峰值(圖1B)。剪接體組分Bud31是剪接體組裝和催化活性所必需的,它的表達(dá)模式與其他剪接事件在時間上協(xié)調(diào),所以選擇它進(jìn)行深入研究。此外,Bud31和未分化精原細(xì)胞的標(biāo)記物Dazl的免疫熒光共染色顯示,在P4時,Bud31存在于生精小管Dazl陽性細(xì)胞中,且主要定位于細(xì)胞核(圖1C)。

為闡明Bud31在精子發(fā)生中的潛在作用,將VASA-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Bud31-floxed小鼠雜交,構(gòu)建生殖細(xì)胞特異性Bud31敲除小鼠(Bud31- vKO)。對輸精管生殖細(xì)胞標(biāo)記物DAZL和Bud31進(jìn)行免疫染色,證實Bud31- vKO小鼠生殖細(xì)胞P4時Bud31缺失(圖1D)。此外,與同窩對照小鼠相比,Bud31-vKO小鼠的睪丸要小得多(圖1E)。與這種表型一致,蘇木精染色顯示Bud31-vKO小鼠睪丸中的生殖細(xì)胞數(shù)量與同窩對照組相比顯著減少(圖1F)。支持細(xì)胞標(biāo)記物Sox9和生殖細(xì)胞標(biāo)記物Gcna的免疫熒光共染顯示,在Bud31-vKO的睪丸中完全沒有Gcna陽性細(xì)胞,但對照小鼠在P10時睪丸中存在Gcna(圖1G)。這些結(jié)果表明Bud31是精子發(fā)生所必須的。


圖1生殖細(xì)胞特異性Bud31基因敲除導(dǎo)致雄性完全不育

 

2、Bud31敲除導(dǎo)致SSC自我更新嚴(yán)重缺陷

為探究Bud31-vKO小鼠生殖細(xì)胞丟失的原因,進(jìn)行SSC標(biāo)志物Plzf的免疫組化,發(fā)現(xiàn)其在正常小鼠表達(dá)在Bud31-vKO小鼠丟失。為了研究Bud31-vKO小鼠SSC缺失的發(fā)生時間,在Bud31- vko和對照小鼠的P1、P2、P3、P4和P5的輸精管中分別對Bud31和Plzf進(jìn)行免疫染色。與對照組比較,Plzf陽性細(xì)胞顯著丟失的第一個時間點是P4(圖2A-B)。此外,對Bud31-vKO小鼠P5時期的生精小管進(jìn)行SSC另一個標(biāo)志物L(fēng)in28a免疫染色,結(jié)果顯示共表達(dá)Lin28a和Plzf的細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組(圖2C)。用qPCR檢測P4睪丸中SSC標(biāo)記(Plzf、Lin28a、Gfrα1和Id4)的表達(dá),與對照組相比,Bud31-vKO睪丸中這些標(biāo)記的表達(dá)水平顯著降低(圖2D)。流式細(xì)胞儀分析顯示,與對照組相比,Bud31-vKO睪丸P4時表達(dá)SSC表面標(biāo)記物Thy1而不表達(dá)c-Kit的細(xì)胞數(shù)量從3.4%下降到2.26%(圖2E)。證實SSC的數(shù)量早在P4時就減少了。對來自P4時期的Bud31-vKO和對照小鼠的Thy1+/c-Kit分選的SSCs進(jìn)行SMART-seq分析,對差異表達(dá)基因的GO和GSEA分析顯示,PI3K-AKT-mTOR信號通路明顯富集,這是正常SSC自我更新的重要通路(圖2F-G)。免疫印跡驗證了P4時期Bud31-vKO小鼠的Thy1+/c-KitSSCs中mTOR信號成分的水平降低(圖2H)。這些結(jié)果提示Bud31參與新生小鼠SSC自我更新的調(diào)節(jié)。

 

圖2Bud31敲除導(dǎo)致SSC自我更新嚴(yán)重缺陷

 

3、Bud31缺失雄性小鼠生殖細(xì)胞無法進(jìn)入減數(shù)分裂

為評估Bud31在雄性減數(shù)分裂中的潛在作用,將Stra8-GFPCre小鼠與Bud31flox/flox小鼠雜交獲得生殖細(xì)胞特異性Bud31敲除雄性小鼠(Bud31- sKO。木素染色顯示Bud31-sKO小鼠的減數(shù)分裂細(xì)胞在P10和P12時期與同窩對照組相比大幅減少(圖3A)。對P12小鼠輸精管減數(shù)分裂標(biāo)志物SYCP3和γH2AX進(jìn)行免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)Bud31-sKO睪丸的SYCP3和γH2AX雙陽性細(xì)胞與對照組相比顯著減少(圖3B)。重要的是,在Bud31-sKO的P12睪丸中沒有觀察到晚于具有瘦素前期樣染色體的精母細(xì)胞,而此時在對照睪丸中已經(jīng)很明顯地發(fā)現(xiàn)了豐富的合子染色體(圖3C)。這表明Bud31是生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂所必需的。

Stra8的表達(dá)是生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂所必需的,在P10小鼠的生精小管中對Stra8進(jìn)行免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,Bud31-sKO睪丸中的Stra8信號明顯減弱(圖3D)。qPCR檢測顯示,與對照組相比,P10期Bud31-sKO小鼠中Stra8及其已知下游轉(zhuǎn)錄激活靶點Hoxa1和Cyp26a1的水平顯著下降(圖3E)。qPCR和免疫印跡評估Stra8,與對照組相比,P4期Bud31-vKO睪丸的Stra8水平顯著降低(圖3F-G)。這些結(jié)果再次支持Bud31具有調(diào)節(jié)減數(shù)分裂起始的功能。


圖3缺乏bud31的雄性生殖細(xì)胞無法進(jìn)入減數(shù)分裂

 

4、Bud31在生精細(xì)胞中調(diào)控AS

為探索Bud31在精子發(fā)生中對AS的作用,使用rMATS對SMART-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行AS分析。Bud31缺失導(dǎo)致了總共1948個AS事件(圖4A-B)。隨后分析reads的映射分布,發(fā)現(xiàn)Bud31缺失顯著降低了外顯子reads的比例,增加了內(nèi)含子和基因間reads的比例(圖4C)。此外,利用SMART-seq數(shù)據(jù)計算剪接效率,發(fā)現(xiàn)敲除Bud31后,5 '剪接位點和3 '剪接位點的效率均顯著降低(圖4D),表明Bud31缺失后AS受損。

為確定Bud31在精子發(fā)生中的全基因組結(jié)合位點和靶點,利用P14野生型小鼠的生精細(xì)胞進(jìn)行RIP-seq,RIP峰值分布分析顯示,Bud31主要定位于pre- mRNA的內(nèi)含子區(qū)域(圖4E)。進(jìn)一步分析了reads強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)Bud31在剪接位點周圍的exon-intron區(qū)域高度富集(圖4F)。此外,使用HOMER算法來識別Bud31識別的RNAmotif,發(fā)現(xiàn)最豐富的元件是UUUAAAA和GAGGCAGG(圖4G),這對識別潛在的結(jié)合位點很有用。

為在生精細(xì)胞中識別Bud31調(diào)控的AS候選靶點,將來自RIP-seq數(shù)據(jù)中的Bud31結(jié)合基因(3258個基因)與來自SMART-seq數(shù)據(jù)集的AS相關(guān)基因(1591個基因)進(jìn)行了比較,并鑒定出392個交集基因(圖4H)。對392個基因進(jìn)行通路富集分析,發(fā)現(xiàn)包括減數(shù)分裂細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂在內(nèi)的通路高度富集(圖4I)。以上結(jié)果表明Bud31在生精細(xì)胞中調(diào)控AS。

 

圖4 Bud31在生精細(xì)胞中調(diào)控AS

 

5、Bud31缺失導(dǎo)致Cdk2第一個內(nèi)含子的保留增加

為確定導(dǎo)致Bud31cKO小鼠表型的靶點,在Bud31缺失時檢測了392個基因和701個下調(diào)基因(圖4J)。發(fā)現(xiàn)12個基因,包括Cdk2,Ccdc62和Lbr都是差異剪接和下調(diào)的(圖4K)。作者關(guān)注Cdk2,它對小鼠的生存能力并不重要,但其缺失已被證明會導(dǎo)致男性不育[29]。SMART-seq分析顯示,Bud31的中斷導(dǎo)致Cdk2前mRNA的第一個內(nèi)含子的保留(圖5A,上),RIP-seq數(shù)據(jù)支持Bud31結(jié)合Cdk2的內(nèi)含子1(圖5A,下)。用半定量RT-PCR方法驗證Bud31對Cdk2的影響,該方法在P10Bud31-sKO和同源對照小鼠的睪丸中使用了同源引物(圖5B)。為獲得進(jìn)一步的證據(jù),構(gòu)建了跨越內(nèi)含子1的小基因,并通過將小基因與Bud31siRNA結(jié)合轉(zhuǎn)染GC-1細(xì)胞來進(jìn)行剪接試驗。Bud31的耗竭顯著增加了Cdk2的內(nèi)含子保留的轉(zhuǎn)錄物(圖5C)。用qPCR分析了P10睪丸中長短異構(gòu)體的比例,觀察到Bud31缺失后Cdk2的長短異構(gòu)體比例明顯增加(圖5D)。此外,為證實Bud31對Cdk2的影響,進(jìn)行剪接報告試驗。使用siRNAs對Bud31進(jìn)行敲除,顯著降低了由含Cdk2內(nèi)含子1的報告片段編碼的熒光素酶活性(圖5E)。為獲得Bud31與Cdk2直接結(jié)合的進(jìn)一步證據(jù),使用Bud31抗體在P14小鼠睪丸中進(jìn)行RIP試驗,如預(yù)期地,RIP-qPCR顯示Bud31與Cdk2pre-mRNA的內(nèi)含子1結(jié)合(圖5F)。此外,RNA pull-down實驗顯示Bud31被生物素標(biāo)記的Cdk2探針成功下拉(圖5G)。

內(nèi)含子保留可以在轉(zhuǎn)錄后水平上減少基因表達(dá)。因此,在P10小鼠睪丸中進(jìn)行qPCR,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,Bud31-sKO小鼠睪丸中的Cdk2表達(dá)明顯下調(diào)(圖5H)。還發(fā)現(xiàn),在GC-1細(xì)胞中,由siRNA介導(dǎo)的對Bud31的敲除導(dǎo)致Cdk2水平明顯降低(圖5I)。免疫印跡法進(jìn)一步證明,與對照組相比,Bud31-vKO小鼠睪丸中這兩種蛋白的異構(gòu)體都明顯減少(圖5J)。這些發(fā)現(xiàn)表明,Bud31的缺失導(dǎo)致內(nèi)含子1的保留,從而導(dǎo)致Cdk2的表達(dá)減少??傊?,這些數(shù)據(jù)表明,Bud31介導(dǎo)的替代剪接參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)。


圖5Bud31缺失導(dǎo)致Cdk2第一個內(nèi)含子的保留增加

 

參考文獻(xiàn):

Qin, J., Huang, T., Wang, Z. et al. Bud31-mediated alternative splicing is required for spermatogonial stem cell self-renewal and differentiation. Cell Death Differ 30, 184–194 (2023). https://doi.org/10.1038/s41418-022-01057-1