LncRNA BCAR4-乳腺癌遷移、侵襲和化療耐藥的靶點(diǎn)

乳腺癌的轉(zhuǎn)移和耐藥已成為成功治療患者的障礙。lncRNAs被認(rèn)為是癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要參與者。LncRNA BCAR4在乳腺癌患者組織和血漿中顯著升高，并在乳腺癌細(xì)胞系中上調(diào)。BCAR4上調(diào)與TNM分期相關(guān)，手術(shù)切除乳腺腫瘤后BCAR4下調(diào)。BCAR4的沉默抑制了乳腺癌細(xì)胞的集落形成、遷移、侵襲和異種移植瘤的生長(zhǎng)，并促進(jìn)了化療敏感性。在機(jī)制上，BCAR4通過(guò)MAPK通路的miR-644a-CCR7軸促進(jìn)乳腺癌的遷移和侵襲。BCAR4通過(guò)與miR-644a結(jié)合并下調(diào)miR-644a，間接促進(jìn)ABCB1表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌化療耐藥。我們的發(fā)現(xiàn)為BCAR4的致癌作用提供了見(jiàn)解，并暗示BCAR4作為一種潛在的診斷生物標(biāo)志物和一種有前途的治療藥物，可以抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移和抑制化療耐藥。本文于2023年1月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）BCAR4在乳腺癌組織和血漿樣本中顯著上調(diào)

我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和StarBase V3.0中檢測(cè)了BCAR4在乳腺癌組織中的表達(dá)。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，BCAR4在1097個(gè)乳腺癌組織中表達(dá)高于114個(gè)非癌性乳腺組織(圖1A)。在StarBase V3.0中觀察到類(lèi)似的結(jié)果(圖1B)。接著，我們檢測(cè)了80例乳腺癌患者和80例健康對(duì)照組的血漿樣本中BCAR4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)乳腺癌血漿樣本中BCAR4水平明顯升高(圖1C)， III期和IV期的BCAR4水平明顯高于I期和II期(圖1D)。此外，我們分析了20對(duì)乳腺癌患者術(shù)前和術(shù)后血漿樣本。術(shù)后血漿樣本中BCAR4水平顯著降低(圖1E)。最后，我們檢測(cè)了BCAR4在不同乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。BCAR4在MDA-MB-231和MCF-7中均有高表達(dá)(圖1F)，因此我們選擇了這兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這些結(jié)果表明BCAR4在乳腺癌腫瘤和血漿樣本中顯著上調(diào)。

2）BCAR4的下調(diào)抑制乳腺癌的遷移、侵襲和DOX耐藥

為探討BCAR4在乳腺癌中的作用，將BCAR4 siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞。RT-qPCR檢測(cè)顯示，BCAR4 siRNA (si-1#、si-2#和si-3#)顯著抑制BCAR4的表達(dá)，其中si-2#的抑制作用最大(圖2A和E)。Transwell檢測(cè)顯示si-2#降低了MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲(圖2B、C、D、F、G和H)。傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明，抑制BCAR4可減少乳腺癌細(xì)胞的遷移(圖2I和J)。si-2#可顯著減少乳腺癌細(xì)胞中的菌落數(shù)量(圖2K和L)。此外，抑制BCAR4可降低MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中DOX的50%抑制濃度(IC50)(圖2M和N)。western blot檢測(cè)顯示，抑制BCAR4可下調(diào)ABCB1和兩種間充質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin和VEGF)的表達(dá)，并上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)(圖2O)。綜上所述，這些結(jié)果支持BCAR4的下調(diào)可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、化療耐藥、還有潛在的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

3）BCAR4下調(diào)miR-644a的表達(dá)

為了研究BCAR4促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的潛在機(jī)制，我們尋找了與BCAR4結(jié)合的miRNA。在StarBase V3.0中預(yù)測(cè)miR-644a會(huì)與BCAR4相互作用(圖3A)。HEK-293T、MDA-MB-231和MCF-7中的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-644a會(huì)抑制BCAR4野生型(WT)構(gòu)建物的熒光素酶活性，但在突變型(MUT，圖3B、D和F)中不會(huì)。下調(diào)miR-644a會(huì)顯著增加WT BCAR4的熒光素酶活性，但在MUT中不會(huì)(圖3C、E和G)。BCAR4的下調(diào)導(dǎo)致MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中miR-644a顯著上調(diào)(圖3H)。此外，80例乳腺癌患者血漿樣本中miR-644a水平低于健康對(duì)照組(圖3I)。80例乳腺癌患者血漿中BCAR4和miR-644a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖3J)。與非癌乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100相比，miR-644a在不同的乳腺癌細(xì)胞中也被下調(diào)(圖3K)。這些結(jié)果表明BCAR4在乳腺癌中直接結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-644a。

4）BCAR4在乳腺癌細(xì)胞中通過(guò)miR-644a下調(diào)促進(jìn)遷移、侵襲和化療耐藥性

我們用BCAR4 siRNA + miR-644a inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞。乳腺癌細(xì)胞中，miR-644a抑制逆轉(zhuǎn)了BCAR4沉默導(dǎo)致的集群形成減少(圖4A, B)。傷口愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，共轉(zhuǎn)染miR-644a抑制劑逆轉(zhuǎn)了BCAR4 siRNA介導(dǎo)的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲減少(圖4C-4F)。此外，BCAR4沉默降低了細(xì)胞活力和DOX的IC50，這在MDA-MB-231細(xì)胞中被miR-644a抑制劑逆轉(zhuǎn)(圖4G)。此外，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-644a抑制劑逆轉(zhuǎn)了BCAR4抑制導(dǎo)致的ABCB1、Vimentin和VEGF的下調(diào)以及E-cadherin的上調(diào)(圖4H)。這些結(jié)果表明，BCAR4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和化療耐藥性，至少部分是通過(guò)miR-644a的下調(diào)實(shí)現(xiàn)的。

5）MiR-644a直接靶向CCR7，通過(guò)MAPK信號(hào)調(diào)節(jié)遷移和侵襲

我們將miR-644a模擬物和抑制劑引入MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行功能增益和功能損失研究。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染miR-644a mimic的MDA-MB-231細(xì)胞形成的集落比對(duì)照細(xì)胞少。相反，轉(zhuǎn)染miR-644a inhibitor的MDA-MB-231細(xì)胞的菌群數(shù)量明顯高于對(duì)照細(xì)胞(圖5A)。過(guò)表達(dá)miR-644a顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲，而抑制miR-644a則促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲(圖5B, C)。轉(zhuǎn)染miR-644a mimic的MDAMB-231細(xì)胞存活率和對(duì)DOX的IC50降低，而miR-644a inhibitor則顯示相反的結(jié)果(圖5D)。根據(jù)TargetScan、miRTarBase和miRDB的預(yù)測(cè)，13個(gè)候選基因的3'UTR具有miR-644a結(jié)合位點(diǎn)(圖5E)。我們專(zhuān)注于CCR7基因(圖5E)。CCR7及其配體CCL19通過(guò)觸發(fā)PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT3等多種信號(hào)通路，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過(guò)程。在TCGA數(shù)據(jù)集中，與非癌性乳腺組織(圖5F)。值得注意的是，CCR7在I期、II期和III期的表達(dá)較高(圖5G)。特別是，當(dāng)將乳腺腫瘤按分子亞型進(jìn)行分層時(shí)，CCR7在腔內(nèi)、HER2陽(yáng)性、三陰性腫瘤中的表達(dá)明顯高于非癌性乳腺組織(圖5H)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-644a負(fù)向調(diào)控CCR7 WT 3’UTR的熒光素酶活性，但對(duì)突變體沒(méi)有影響(圖5I)。相反，當(dāng)miR-644a被抑制時(shí)，含有野生型3’UTR的HEK-293T細(xì)胞中熒光素酶活性明顯升高(圖5J)。在MDA-MB-231細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-644a顯著下調(diào)ABCB1、Vimentin、VEGF、CCR7、p-ERK和p-p38，上調(diào)E-cadherin。抑制miR-644a對(duì)這些蛋白水平有相反的影響(圖5K)。此外，在共轉(zhuǎn)染miR-644a抑制劑的MDA-MB-231細(xì)胞中，BCAR4抑制導(dǎo)致的CCR7、p-ERK和p-p38的下調(diào)被逆轉(zhuǎn)(圖5L)。

6）下調(diào)BCAR4可減少體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

為了評(píng)估BCAR4下調(diào)是否會(huì)減少體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，我們將MDA-MB-231細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠的乳腺脂肪墊中。用體內(nèi)BCAR4 siRNA或?qū)φ战M治療異種移植腫瘤3周。我們發(fā)現(xiàn)，siBCAR4治療小鼠的腫瘤發(fā)展比對(duì)照組慢(圖6A和B)。肺和肝臟活檢顯示si-BCAR4小鼠的肺和肝臟轉(zhuǎn)移較少(圖6C和D)。此外，免疫組織化學(xué)分析表明si-BCAR4可明顯提高E-cadherin的表達(dá)，抑制CCR7、VEGF和Vimentin的表達(dá)(圖6E)。這些結(jié)果表明，下調(diào)BCAR4可通過(guò)提高體內(nèi)CCR7的表達(dá)，顯著降低乳腺癌的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

結(jié)論：

我們發(fā)現(xiàn)BCAR4通過(guò)miR-644a-CCR7軸和MAPK通路加速乳腺癌的遷移和侵襲。BCAR4還上調(diào)ABCB1以誘導(dǎo)乳腺癌的化療耐藥。這些發(fā)現(xiàn)表明BCAR4是乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Wu T, Li X, Yan G, Tan Z, Zhao D, Liu S, Wang H, Xiang Y, Chen W, Lu H, Liao X, Li Y, Lu Z. LncRNA BCAR4 promotes migration, invasion, and chemo-resistance by inhibiting miR-644a in breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jan 10;42(1):14. doi: 10.1186/s13046-022-02588-8.