9分文章揭秘——去乙?；?lián)泛素化促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

實(shí)驗(yàn)方法：質(zhì)粒構(gòu)建，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，Western blot，免疫沉淀（IP），實(shí)時熒光定量PCR，LC-MS/MS分析，細(xì)胞增殖，克隆形成，Transwell，劃痕實(shí)驗(yàn)，免疫熒光，動物實(shí)驗(yàn)，免疫組化

乙?；揎椩谀[瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。磷脂酰磷組氨酸無機(jī)焦磷酸鹽磷酸酶（LHPP）在某些腫瘤中下調(diào)，具有抑制腫瘤的作用。然而，LHPP在鼻咽癌（NPC）中的表達(dá)調(diào)控及其功能尚不清楚。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)LHPP在鼻咽癌中下調(diào)，并且LHPP的過表達(dá)抑制了鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲。在機(jī)制上，HDAC4在K6處使LHPP去乙酰化，并通過TRIM21介導(dǎo)的k48連鎖泛素化促進(jìn)LHPP的降解。證實(shí)HDAC4在鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過LHPP促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LHPP可以抑制酪氨酸激酶TYK2的磷酸化，從而抑制STAT1的活性。在體內(nèi)，敲除HDAC4或靶向HDAC4的小分子抑制劑Tasquinimod可通過上調(diào)LHPP顯著抑制NPC的增殖和轉(zhuǎn)移。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明HDAC4/LHPP信號軸通過上調(diào)TYK2-STAT1磷酸化激活促進(jìn)鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究將為鼻咽癌轉(zhuǎn)移提供新的證據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、LHPP在NPC中去乙?；?/span>且低表達(dá)

為研究NPC中去乙酰化直接調(diào)控的抑癌蛋白，用廣譜HDACi（組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589處理NPC HK1細(xì)胞，用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析數(shù)據(jù)（圖1A）。聚類熱圖分析表明，LBH589處理后，23個蛋白的乙?；斤@著上調(diào)（fold change > 3 , p < 0.05）（圖1B）。其中，LHPP是乙?；缴险{(diào)最明顯的3個分子之一，也是3個分子中唯一的修飾酶。為證實(shí)LHPP在NPC細(xì)胞中受乙?；苯诱{(diào)控，分別用LBH589和另一種廣譜HDACi Belinostat（PXD101）處理HK1和5-8F細(xì)胞，并用泛乙酰化抗體（Acetylation-lysine）進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)。與內(nèi)源性結(jié)果一致，數(shù)據(jù)顯示HDACi顯著提高LHPP的乙?；剑▓D1C）。進(jìn)一步，用Flag- LHPP轉(zhuǎn)染HK1和5-8F細(xì)胞，并用HDACi處理，用Flag或乙?；嚢彼峥贵w進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，分別檢測外源LHPP的乙?；?。與內(nèi)源性結(jié)果一致，數(shù)據(jù)顯示在HDACi處理后LHPP的乙酰化水平明顯上調(diào)（圖1D-E）。為進(jìn)一步分析LHPP的乙?；绞欠裼绊懙鞍妆磉_(dá)，進(jìn)行了western blot分析，結(jié)果顯示HDACi處理顯著增加NPC細(xì)胞中LHPP的蛋白表達(dá)（圖1F）。同時，與人正常鼻咽細(xì)胞NP69相比，LHPP在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)（圖1G）。對臨床NPC樣本進(jìn)行IHC分析發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，LHPP在腫瘤組織中低表達(dá)（圖1H）。綜上所述，LHPP在NPC中低表達(dá)，可能是由去乙?；揎椧鸬?。

圖1 LHPP在NPC中去乙?；业捅磉_(dá)

2、過表達(dá)LHPP可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲

為研究LHPP在鼻咽癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，將pcDNA3.1-LHPP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NPC細(xì)胞HK1、5-8F和HONE1。CCK8實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，LHPP過表達(dá)降低了NPC細(xì)胞活力（p < 0.001）（圖2A）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，LHPP過表達(dá)細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯降低（p < 0.01）（圖2B）。劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)LHPP過表達(dá)細(xì)胞的遷移能力降低（p < 0.01）（圖2C）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)LHPP細(xì)胞的侵襲能力也明顯受到抑制（p < 0.01）（圖2D）。因此，LHPP抑制NPC細(xì)胞的增殖和侵襲。

圖2過表達(dá)LHPP可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲

3、HDAC4介導(dǎo)LHPP去乙?；?/span>

為鑒定介導(dǎo)LHPP去乙酰化的調(diào)控酶，分別用曲古抑菌素A（TSA，HDAC家族去乙?；敢种苿┖蜔燉０罚∟AM，SIRT家族去乙酰化酶抑制劑）處理HK1和5-8F細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSA處理后LHPP蛋白增加，而NAM處理后LHPP蛋白變化不明顯（圖3A）。使用兩種選擇性去乙酰化酶抑制劑LMK-235（主要針對HDAC4/5）和MS-275（靶向HDAC1/3/2）處理NPC細(xì)胞后，結(jié)果顯示LMK-235可明顯上調(diào)LHPP蛋白表達(dá)（圖3B）。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-LHPP和His-HDAC4/5質(zhì)粒，IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LHPP可以與HDAC4相互作用，但不能與HDAC5相互作用（圖3C）。HK1和5-8F細(xì)胞的內(nèi)源性IP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了LHPP與HDAC4的相互作用（圖3D）。與此結(jié)果一致，免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明LHPP和HDAC4主要共定位于NPC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖3E）。此外，IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)HDAC4可以顯著降低LHPP的乙酰化水平（圖3F），western blot結(jié)果顯示下調(diào)HDAC4后LHPP表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)HDAC4后LHPP表達(dá)下調(diào)（圖3G）。這些結(jié)果表明，在NPC細(xì)胞中，HDAC4負(fù)調(diào)控LHPP的表達(dá)。此外，在作者的前期實(shí)驗(yàn)中，用LBH589處理NPC HK1細(xì)胞后，通過LC-MS/MS鑒定了LHPP的K6乙酰化（圖3H）。將Flag-LHPP、K6R（模擬去乙酰化）和K6Q（模擬乙?；┵|(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞后，IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示K6R突變顯著降低LHPP乙?；?，而K6Q突變不影響LHPP乙?；▓D3I）。這些結(jié)果表明HDAC4通過K6去乙酰化抑制LHPP的表達(dá)。

圖3 HDAC4調(diào)控LHPP的去乙酰化

4、LHPP的去乙酰化促進(jìn)TRIM21介導(dǎo)的k48相關(guān)泛素化降解

為探究去乙?；种芁HPP表達(dá)的機(jī)制，在HK1和5-8F細(xì)胞中敲低HDAC4后，qPCR結(jié)果顯示LHPP mRNA無明顯變化，提示HDAC4對LHPP的抑制主要通過翻譯后修飾調(diào)控。隨后，建立HDAC4敲低穩(wěn)定細(xì)胞株HK1-shHDAC4和5-8F-shHDAC4。Western blot結(jié)果顯示，在蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）處理下，HDAC4敲低能夠抑制LHPP的降解（圖4A）。進(jìn)一步利用Flag LHPP質(zhì)粒構(gòu)建LHPP過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株5-8F-LHPP-OE。IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低HDAC4后，LHPP的泛素化水平明顯降低（圖4B）。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HA-Ub和Flag-LHPP、K6R和K6Q質(zhì)粒后，結(jié)果顯示K6R導(dǎo)致泛素化增加，表明LHPP的泛素化依賴于其K6去乙?；▓D4C）。不同類型的泛素連接賦予泛素化不同的功能。K48連接的泛素化主要參與蛋白酶體途徑降解，K63連接的泛素化主要參與蛋白穩(wěn)定性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為明確LHPP的泛素連接類型，內(nèi)源性IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LHPP的泛素化主要是K48連接，而K63連接的泛素化沒有觀察到（圖4D）。與此一致，F(xiàn)lag-LHPP以及HA-Ub、HA-K48和HA-K48R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證LHPP的K48位泛素化（圖4E）。為闡明調(diào)控LHPP的E3連接酶，將Flag-LHPP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入5-8F細(xì)胞中，進(jìn)行IP和質(zhì)譜分析，鑒定與LHPP相互作用的蛋白。結(jié)果表明TRIM21可能是作用于LHPP的主要E3連接酶（圖4F）。IP實(shí)驗(yàn)表明TRIM21確實(shí)與LHPP存在相互作用（圖4G）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)也顯示LHPP與TRIM21的共定位主要存在于NPC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖4H）。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染His-TRIM21、Flag-LHPP和HA-Ub質(zhì)粒后，結(jié)果顯示TRIM21過表達(dá)增加LHPP泛素化（圖4I）。在轉(zhuǎn)染si TRIM21的5-8F-LHPP-OE細(xì)胞中進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示敲低TRIM21后，LHPP的K48位泛素化水平降低（圖4J）。這些結(jié)果表明TRIM21促進(jìn)NPC細(xì)胞中LHPP的蛋白酶體依賴性降解。為確定LHPP乙?；赥RIM21介導(dǎo)的泛素化中的作用，進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)表明K6R增強(qiáng)LHPP與TRIM21的相互作用（圖4K）。上述結(jié)果說明，LHPP的去乙酰化促進(jìn)TRIM21介導(dǎo)的K48連接的泛素化和降解，從而降低LHPP的穩(wěn)定性和表達(dá)。

圖4 LHPP的去乙酰化促進(jìn)TRIM21介導(dǎo)的k48相關(guān)泛素化降解

5、HDAC4通過LHPP促進(jìn)NPC細(xì)胞增殖和侵襲

為闡明HDAC4是否通過LHPP影響NPC細(xì)胞的增殖和侵襲，建立了HDAC4和LHPP雙敲低的穩(wěn)定NPC細(xì)胞系。CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低HDAC4后細(xì)胞增殖能力下降，而雙敲低HDAC4和LHPP可逆轉(zhuǎn)shHDAC4處理介導(dǎo)的NPC細(xì)胞增殖抑制（圖5A-B）。劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示HDAC4敲低后細(xì)胞遷移和侵襲能力受到抑制，雙敲低HDAC4和LHPP可以挽救HDAC4敲低介導(dǎo)的抑制（圖5C-D）。這些結(jié)果表明HDAC4通過抑制LHPP促進(jìn)NPC細(xì)胞的增殖和侵襲。

圖5 HDAC4通過LHPP促進(jìn)NPC細(xì)胞增殖和侵襲

6、LHPP抑制NPC中酪氨酸激酶TYK2的磷酸化

為探究在NPC細(xì)胞中LHPP直接調(diào)控的下游激酶，在5-8F細(xì)胞中過表達(dá)LHPP后，進(jìn)行IP和質(zhì)譜分析。鑒定到3個激酶HK2、Tyrosine kinase 2（TYK2）和MAP4K4，未發(fā)現(xiàn)AKT和GSK-3β（圖6A）。結(jié)果提示LHPP可能存在其他直接靶向的激酶。在LHPP過表達(dá)的5-8F-LHPP-OE細(xì)胞中，Western blot結(jié)果顯示TYK2的磷酸化水平明顯降低，而HK2的磷酸化水平無明顯變化（圖6B）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)在5-8F細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-LHPP，結(jié)果顯示LHPP可以與P-TYK2相互作用（圖6C）。免疫熒光數(shù)據(jù)也證實(shí)P-TYK2和LHPP主要共定位于NPC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（圖6D）。在HK1、HONE1和5-8F細(xì)胞中過表達(dá)LHPP后，Western blot檢測結(jié)果顯示STAT1磷酸化水平明顯降低，TYK2磷酸化激活水平下調(diào)，而STAT3磷酸化水平無明顯變化（圖6E）。35例人臨床鼻咽癌樣本的IHC分析結(jié)果顯示，LHPP與HDAC4、P-TYK2和P-STAT1呈顯著負(fù)相關(guān)，而HDAC4與P-TYK2和P-STAT1呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明，LHPP通過抑制TYK2的磷酸化激活來降低STAT1的磷酸化。

圖6 LHPP抑制鼻咽癌酪氨酸激酶TYK2的磷酸化

7、HDAC4在體內(nèi)通過抑制LHPP的表達(dá)促進(jìn)NPC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

為評估LHPP在體內(nèi)對NPC生長的影響，作者使用5-8F-LHPP-OE細(xì)胞建立異種移植瘤模型。結(jié)果顯示，與對照組相比，LHPP過表達(dá)顯著抑制了皮下移植瘤的生長（圖7A-C）。IHC染色分析表明LHPP的過表達(dá)抑制P-TYK2和PSTAT1的表達(dá)，增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)降低（圖7D）。此外，腫瘤轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，與對照組相比，5-8F-sh HDAC4組和Tasquinimod處理組均顯著減少了肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量（圖7E-F）。轉(zhuǎn)移灶中HDAC4、LHPP和P-TYK2的IHC染色顯示，sh HDAC4組HDAC4和P-TYK2表達(dá)明顯降低，LHPP水平升高（圖7G）。以上結(jié)果說明，抑制HDAC4可以增加LHPP的表達(dá)，從而抑制TYK2/STAT1信號，抑制鼻咽癌的生長和轉(zhuǎn)移。

圖7 HDAC4在體內(nèi)通過抑制LHPP的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移

圖8 LHPP在鼻咽癌細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制及功能模型

結(jié)論

總之，作者的工作首次揭示了在NPC中，HDAC4在K6去乙酰化LHPP，通過增強(qiáng)TRIM21介導(dǎo)的K48位泛素化促進(jìn)LHPP的降解，從而失去對TYK2磷酸化激活的抑制作用，上調(diào)STAT1磷酸化，進(jìn)一步促進(jìn)NPC的增殖和轉(zhuǎn)移（圖8）。本研究為靶向NPC轉(zhuǎn)移提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Sun X, Zhang K, Peng X, Zhou P, Qu C, Yang L, Shen L. HDAC4 mediated LHPP deacetylation enhances its destabilization and promotes the proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 2023 Apr 5;562:216158. doi: 10.1016/j.canlet.2023.216158. Epub ahead of print. PMID: 37023940.