BHLHE22驅(qū)動前列腺癌免疫抑制性骨腫瘤微環(huán)境及相關(guān)骨轉(zhuǎn)移

實驗方法：免疫組織化學(xué)（IHC），免疫熒光（IF），流式細胞術(shù)，生物信息學(xué)分析，RNA測序，細胞因子陣列，蛋白質(zhì)印跡，熒光素酶報告基因，染色質(zhì)免疫沉淀測定，DNA pulldown、免疫共沉淀，動物實驗

骨是晚期前列腺癌（Pca）最常見的遠處轉(zhuǎn)移部位。在骨腫瘤微環(huán)境（TME）中，獨特的骨髓微環(huán)境和髓系細胞參與了骨腫瘤的轉(zhuǎn)移、定植、休眠、激活和免疫逃逸。在過去的幾十年中，晚期Pca的診斷率從3.9%增加到8.2% ，高達90%的晚期Pca患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。晚期PCa的治療措施有限，包括雄激素剝奪治療、生物靶向治療和骨靶向藥物治療，且PCa最終會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移進展，成為一種致死性疾病。免疫檢查點治療（ICT）已被證明對多種實體腫瘤有效。然而，骨轉(zhuǎn)移性PCa傳統(tǒng)上被認為是“免疫沙漠”，導(dǎo)致ICT應(yīng)答不佳。BHLHE22是堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員，其峰值表達與晚期PCa細胞的轉(zhuǎn)化進展相關(guān)。然而腫瘤BHLHE22在Pca骨轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. BHLHE22在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中表達上調(diào)，在轉(zhuǎn)移骨組織中進一步升高

通過免疫組織化學(xué)染色檢測BHLHE22在222例PCa組織中的表達，探討其在PCa轉(zhuǎn)移中的潛在作用。作者發(fā)現(xiàn)，與無骨轉(zhuǎn)移的原發(fā)性PCa（PCa/nBM）相比，BHLHE22在有骨轉(zhuǎn)移的原發(fā)性PCa（PCa/BM）中的表達顯著增加，并且在BM組織中進一步上調(diào)（圖1A）。然后，作者分析了人類PCa表達譜GSE77930，發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性PCa和其他內(nèi)臟轉(zhuǎn)移部位相比，BHLHE22在轉(zhuǎn)移性骨組織中的表達顯著上調(diào)（圖1B）。基于癌癥基因組圖譜（TCGA-PRAD）數(shù)據(jù)集的進一步分析表明，與PCa/nBM相比，BHLHE22在PCa/BM中的表達顯著增加（圖1C）。此外，基于TCGA-PRAD的Kaplan-Meier分析表明，BHLHE22高表達預(yù)測較短的無病生存期（圖1D）。一致地，BHLHE22表達上調(diào)預(yù)示著較差的臨床病理特征和較短的總生存期和無BM生存期（圖1E, F）?？傊?，這些結(jié)果表明，BHLHE22的高表達與PCa患者的BM和不良預(yù)后相關(guān)。

圖1 BHLHE22在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中表達上調(diào)，并促進骨轉(zhuǎn)移

2. BHLHE22通過免疫相關(guān)的方式促進BM

為了探討B(tài)HLHE22在前列腺癌中的生物學(xué)功能，作者通過左心室注射熒光素酶標(biāo)記的前列腺癌細胞構(gòu)建了BM小鼠模型。采用生物發(fā)光成像活體監(jiān)測骨轉(zhuǎn)移。RM-1細胞BHLHE 22過表達顯著促進同基因C57BL/6J小鼠的腫瘤BM（圖1G）。然后，通過HE證實了BM，并通過micro-CT掃描對溶骨性病變進行定量（圖1H）。Micro-CT分析表明，BHLHE22導(dǎo)致了更大的溶骨性骨病區(qū)（圖1J, K）。生存分析表明，BHLHE22的過表達預(yù)測了更短的總生存期和無BM生存期（圖1L, M）。綜上所述，在免疫正常和免疫缺陷小鼠之間，BHLHE22驅(qū)動不同的骨髓表型。在體內(nèi)和體外實驗中，BHLHE22引起了一致的表型差異。因此，作者假設(shè)BHLHE22對骨髓狀態(tài)的不同影響可能是由于其對腫瘤骨免疫微環(huán)境的影響所致。

3. BHLHE22驅(qū)動骨髓中的免疫抑制性TME

為了確定BHLHE22是否以及如何影響PCa骨免疫微環(huán)境，作者研究了PCa標(biāo)本中免疫抑制髓系細胞和CD8 T細胞的浸潤。免疫抑制髓系細胞定義為人組織樣本中的CD33細胞20免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞被定義為CD11bGr1細胞，可進一步分為CD11bLy6CloLy6G(中性粒細胞)和CD11bLy6ChiLy6G-(單核細胞)對PCa/BM和BM組織進行CD33、CD8、BHLHE22的組織免疫熒光和4 '，6-二脒基-2-苯基吲哚染色（圖2A, B），結(jié)果提示在PCa/BM和BM組織中BHLHE22-high組比BHLHE22-low組有更多的CD33細胞浸潤。BHLHE22-low組的CD8 T細胞浸潤高于BHLHE22-high組（圖2D, E）。然后，作者在LCV注射RM-1-BHLHE22和RM-1-Vector細胞的C57BL/6J小鼠骨髓樣本中檢測了腫瘤浸潤的CD11bGr-1細胞，以及CD4 T和CD8 T細胞。RM-1-BHLHE22組骨髓中CD11bGr-1細胞浸潤較RM-1-Vector組明顯增加，CD4 T和CD8 T細胞浸潤較RM-1-Vector組明顯減少（圖2C, F）。

為了進一步證實BHLHE22在骨TME中的作用，作者收集了同時注射RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22細胞的C57BL/6J小鼠的骨髓樣本，并使用流式細胞術(shù)進行免疫分析。作者評估了CD11bGr-1細胞在CD457AAD -細胞中的相對比例。與RM-1-Vector組相比，RM-1-BHLHE22組的CD11bGr-1細胞浸潤顯著增加，尤其是單核細胞，而CD4 T和CD8 T細胞浸潤顯著減少（圖2G-J）。進一步研究與免疫功能相關(guān)的關(guān)鍵因子，包括Arg-1、IFN-γ和PD-1。RM-1-BHLHE22組的Arg-1Gr-1細胞（圖2G, H）和PD-1CD8 T細胞比例較高，而IFN-γCD8 T細胞比例較低（圖2I, K）。此外，為了檢測這些CD11bGr-1細胞是否確實是有功能的免疫抑制髓系細胞，作者進行了標(biāo)準(zhǔn)的T細胞共培養(yǎng)增殖抑制試驗。將分離出的CD11bGr-1細胞以不同比例與CD8 T細胞共培養(yǎng)：4天后，CD11bGr-1細胞強烈抑制CD3和CD28抗體誘導(dǎo)的T細胞增殖和活化（圖2L, M）。綜上所述，作者得出結(jié)論，BHLHE22-high PCa細胞誘導(dǎo)的CD11bGr-1細胞通過消耗T細胞來驅(qū)動免疫抑制的TME 。

圖2 BHLHE22在骨轉(zhuǎn)移中驅(qū)動免疫抑制性腫瘤微環(huán)境

4. BHLHE22控制免疫抑制性中性粒細胞

作者分析了RM-1-BHLHE22和PC-3-BHLHE22細胞的RNA-seq數(shù)據(jù)集，并分別與vector細胞進行比較。作者確定了103個共上調(diào)基因和37個共下調(diào)基因。令人驚訝的是，CSF2是RM-1-BHLHE22和PC-3-BHLHE22細胞中唯一共同上調(diào)的分泌因子基因（圖3A）。

細胞因子陣列分析顯示RM-1-BHLHE22細胞比RM-1-Vector細胞分泌更高量的CSF2（圖3B）。Western blot結(jié)果顯示RM-1-BHLHE22組中CSF2的表達水平較高（圖3C, D）。在LCV注射的C57BL/6J小鼠骨髓腫瘤樣本中，作者檢測了CSF2的表達與免疫細胞浸潤的關(guān)系，包括免疫抑制性髓系細胞（Gr-1, S100A9）、CD4 T和CD8 T細胞。BHLHE22過表達組的Gr-1和S100A9細胞計數(shù)較高，CSF2水平高于載體組（圖3E-H）。相關(guān)性分析顯示，CSF2表達與Gr-1細胞浸潤呈正相關(guān)（圖3h）。Ki-67增殖標(biāo)志物的陽性染色表明，BHLHE22誘導(dǎo)的腫瘤浸潤CD11bGr-1細胞促進小鼠的骨髓生長（圖3I）。因此，作者假設(shè)CSF2可能是BHLHE22 PCa誘導(dǎo)的免疫抑制性骨TME的關(guān)鍵介質(zhì)。

接下來，進行了體內(nèi)和體外研究，以評估CSF2中和的治療效果。對于體內(nèi)CD11bGr-1細胞浸潤分析，C57BL/6J小鼠LCV注射RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22細胞。然后，作者用重組鼠CSF2治療非荷瘤小鼠。用抗CSF2抗體處理LCV注射小鼠。采用BLI監(jiān)測腦轉(zhuǎn)移，micro-CT掃描定量分析溶骨性病變。注射后30 d，取骨髓進行流式細胞術(shù)分析。與非荷瘤組相似，腫瘤BHLHE22過表達顯著促進了CD11bGr-1細胞的浸潤。然而，抗CSF2抗體顯著抑制CD11bGr-1細胞浸潤（圖3J）。分離CD11bGr-1細胞，用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯標(biāo)記CD11bGr-1細胞進行體外擴增分析。將分離的CD11bGr-1細胞與RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22細胞共培養(yǎng)。未共培養(yǎng)的CD11bGr-1細胞作為溶劑組。然后，作者用重組鼠CSF2處理非共培養(yǎng)的細胞。用抗CSF2抗體處理共培養(yǎng)細胞。孵育5天后，與CSF2組相似，CFSE實驗顯示腫瘤BHLHE22過表達顯著促進CD11bGr-1細胞擴增。然而，抗CSF2抗體顯著抑制了CD11bGr-1細胞的擴增（圖3K）。因此，作者得出結(jié)論，CSF2是BHLHE22誘導(dǎo)免疫譜改變的關(guān)鍵介質(zhì)。

圖3 BHLHE22控制免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞的募集，CSF2作為關(guān)鍵介質(zhì)發(fā)揮作用

5. BHLHE22和PRMT5形成一個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物并轉(zhuǎn)錄激活CSF2

BHLHE22是一個轉(zhuǎn)錄因子;因此，作者試圖確定CSF2是否受BHLHE22的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示BHLHE22增加RM-1-BHLHE22和PC-3-BHLHE22細胞中CSF2啟動子的活性（圖4A）。BHLHE22通常形成一個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，在多種組織中決定細胞命運。為了確定潛在的蛋白-蛋白相互作用，作者進行了免疫共沉淀試驗。使用質(zhì)譜（MS）分析洗脫液和差異豐度條帶。質(zhì)譜結(jié)果確定了10個潛在轉(zhuǎn)錄輔因子的富集（圖4B）。作者將DNA探針與磁珠偶聯(lián)，并使用未偶聯(lián)的磁珠作為陰性對照。DNA下拉分析顯示，在CSF2啟動子區(qū)域P1和P1-4中，在60和75 kDa之間發(fā)現(xiàn)了相同的差異表達條帶，但在P2、P3和P4中沒有（圖4C）。因此，作者認為P1區(qū)域可能與BHLHE22結(jié)合有關(guān)。此外，細胞IF染色也顯示了BHLHE22和PRMT5在細胞核中的共定位（圖4D）。為了進一步驗證BHLHE22是否結(jié)合到CSF2啟動子的P1區(qū)域來激活基因轉(zhuǎn)錄，作者構(gòu)建了3個CSF2熒光素酶啟動子載體：pGL4-FL-BBS（全長BBS）、pGL4-P1-BBS-Wt（野生型P1區(qū)域）和pGL4-P1-BBS-Mut（突變BBS）。將其轉(zhuǎn)染RM-1-BHLHE22細胞和HEK293T細胞。熒光素酶分析表明P1區(qū)域的突變顯著降低了CSF2啟動子活性（圖4E）。為了進一步確定BHLHE22和PRMT5之間的相互作用，作者進行了內(nèi)源性和外源性免疫共沉淀（IP）實驗。值得注意的是，兩種IP檢測均顯示BHLHE22與PRMT5相互作用（圖4F, G）。

接下來，作者研究了轉(zhuǎn)錄復(fù)合體是如何與靶基因結(jié)合的，以及轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中Bhlh以RM-1-vector、RM-1-BHLHE22和RM-1-BHLHE22-PRMT5-sh 3種RM-1細胞株為研究對象進行芯片定量PCR（chip-qPCR）。作者發(fā)現(xiàn)PRMT5在RM-1-Vector細胞中不能與CSF2啟動子結(jié)合。而在RM-1-BHLHE22和RM-1-BHLHE22- PRMT5 -sh細胞中，ChIP-qPCR顯示BHLHE22與CSF2啟動子的結(jié)合能力相似。然而，在RM-1-BHLHE22細胞中，PRMT5顯示出與CSF2啟動子的強結(jié)合能力（圖4H）。在BHLHE22缺失的情況下，PRMT5不能與CSF2啟動子結(jié)合（圖4H）。因此，PRMT5結(jié)合CSF2啟動子的能力依賴于BHLHE22。這些結(jié)果表明BHLHE22與CSF2啟動子結(jié)合并招募PRMT5形成一個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而激活CSF2的轉(zhuǎn)錄。

圖4 BHLHE22和PRMT5形成一個轉(zhuǎn)錄復(fù)合物并轉(zhuǎn)錄激活CSF2

6. PRMT5表觀遺傳激活CSF2表達

據(jù)報道，PRMT5作為一種表觀遺傳修飾因子，通過甲基化組蛋白來調(diào)節(jié)基因表達。此外，PRMT5通過不同組蛋白的對稱二甲基化在轉(zhuǎn)錄激活或抑制中發(fā)揮作用。在RM-1-BHLHE22細胞中敲低PRMT5后，作者通過蛋白質(zhì)印跡法和實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測CSF2的表達水平。作者還檢測了各種對稱甲基化組蛋白的水平，如H4R3, H3R2和H3R8。值得注意的是，PRMT5敲低誘導(dǎo)H4R3me2a和H3R2me2s水平降低（圖4I）。既往研究表明，H4R3（H4R3me2a）和H3R2（H3R2me2s）二甲基化在腫瘤中可激活基因轉(zhuǎn)錄。隨后，為了確定PRMT5是否可以直接甲基化CSF2啟動子區(qū)域周圍的H4R3和H3R2，作者在RM-1-BHLHE22細胞中進行了幾次ChIP測定。敲低PRMT5降低了H4R3me2a和H3R2me2s在CSF2啟動子上的富集，支持CSF2啟動子是PRMT5的一個二甲基化靶點的觀點（圖4J）。GSK591顯著降低RM-1-BHLHE22細胞中CSF2啟動子上H4R3me2a和H3R2me2s的富集（圖4K）。

為了評估PRMT5對免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞浸潤的影響，作者進行了體內(nèi)和體外研究來評估PRMT5抑制劑的治療效果。PRMT5抑制劑GSK3326595用于體內(nèi)實驗，GSK591用于體外實驗。對于體內(nèi)CD11bGr-1細胞浸潤分析，C57BL/6J小鼠被LCV注射RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22或RM-1-BHLHE22-PRMT5-sh細胞。另一組RM-1-BHLHE22用GSK3326595處理。采用BLI監(jiān)測腦轉(zhuǎn)移，micro-CT掃描定量分析溶骨性病變。注射后30 d，取小鼠骨髓進行流式細胞術(shù)分析。腫瘤BHLHE22過表達顯著促進CD11bGr-1細胞的浸潤。然而，敲低PRMT5和PRMT5抑制劑GSK3326595處理顯著抑制了CD11bGr-1細胞的浸潤（圖4L）。在體外，分離的小鼠CD11bGr-1細胞被CFSE標(biāo)記，并與RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22或RM-1-BHLHE22-PRMT5-sh細胞共培養(yǎng)。另加入GSK591處理RM-1-BHLHE22共培養(yǎng)組。在孵育5天后，CFSE實驗顯示腫瘤BHLHE22過表達顯著促進CD11bGr-1細胞的擴增。然而，敲低PRMT5和PRMT5抑制劑GSK591處理顯著抑制了CD11bGr-1細胞的擴增（圖4M）。綜上所述，這些結(jié)果表明PRMT5表觀遺傳激活CSF2的表達，抑制PRMT5可以減少CD11bGr-1細胞的浸潤。

7. CSF2中和和ICT聯(lián)合治療在體內(nèi)有效抑制腫瘤浸潤的免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞以及骨髓

腫瘤內(nèi)CD4 T細胞的擴增和細胞毒性CD8 T細胞的活化決定了ICT的治療效果。CD11bGr-1細胞驅(qū)動的免疫抑制微環(huán)境是骨轉(zhuǎn)移性PCa對ICT反應(yīng)差的主要原因之一，這促使作者研究是否抑制BHLHE22/PRMT5/CSF2通路可以提高ICT反應(yīng)。

首先，作者在注射RM-1-BHLHE22細胞的C57BL/6J小鼠模型中驗證了作者的假設(shè)。注射后3日，作者開始用抗CSF2和/或抗PD -1抗體治療小鼠（圖5A）。使用BLI監(jiān)測BM，使用micro-CT掃描和TRAP染色測量BM病灶（圖5B, C）。

70 d時終止實驗，測定BM發(fā)生率。在BM發(fā)生率方面，單獨抗CSF2或抗PD-1抗體與對照組無顯著差異。然而，在所有組中，抗CSF2和抗PD-1聯(lián)合治療抑制BM的發(fā)生最有效（圖5D）。盡管如此，與快速進展的對照組相比，單獨使用抗CSF2或抗PD-1抗體治療可減緩腫瘤進展，并縮小BM病變面積；在所有治療組中，聯(lián)合治療組最有效地減緩了腫瘤進展，并減少了BM病變面積（圖5E-G）。生存分析表明，聯(lián)合治療組顯著延長了總生存期和無BM生存期（圖5H）。

隨后，作者使用流式細胞術(shù)進一步檢測了骨髓中免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞以及T細胞的浸潤（圖5J）。與對照組相比，單獨抗CSF2可減少CD11bGr-1細胞浸潤，增加CD4和CD8 T細胞浸潤，但不能促進IFN-γCD8 T細胞擴增（圖5K-M）。單獨抗PD-1促進IFN-γCD8 T細胞的擴增，但對CD11bGr-1細胞、CD4和CD8 T細胞的浸潤無明顯影響（圖5K-M）。值得注意的是，聯(lián)合治療顯著減少了CD11bGr-1細胞的浸潤，增加了CD4和CD8 T細胞的浸潤，并促進了IFN-γCD8 T細胞的擴增（圖5K-M）。綜上所述，這些結(jié)果表明，抗CSF2和抗PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用可以通過緩解免疫抑制來有效增強ICT對BHLHE22前列腺癌的治療效果。

圖5 CSF2中和和免疫檢查點治療聯(lián)合治療可有效抑制體內(nèi)腫瘤浸潤的免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞以及骨轉(zhuǎn)移

8. PRMT5抑制劑聯(lián)合ICT可有效抑制體內(nèi)腫瘤浸潤的免疫抑制性中性粒細胞、單核細胞和骨髓

抑制PRMT5可顯著降低CSF2的表達，減輕免疫抑制性骨TME。因此，作者進一步探索PRMT5抑制劑聯(lián)合ICT能否提高ICT的療效。注射后3日，作者開始用GSK3326595和/或抗PD-1抗體治療小鼠（圖6A）。通過BLI監(jiān)測BM，通過micro-CT掃描和TRAP染色測量BM病灶（圖6B, C）。

于70 d時終止實驗。在骨髓發(fā)生率方面，單獨GSK3326595治療與對照組無顯著差異。然而，GSK3326595和抗PD-1的聯(lián)合治療有效地抑制了BM的發(fā)生（圖6D）。與單獨抗PD-1治療相似，單獨GSK3326595治療略微減緩了腫瘤進展，減少了BM病灶面積；聯(lián)合治療最有效地減緩了腫瘤進展，減少了BM病灶面積（圖6E-G）。生存分析表明，聯(lián)合治療顯著延長了總生存期和無BM生存期（圖6H）。流式細胞術(shù)表明，GSK3326595處理減少了CD11bGr-1細胞的浸潤，并增加了CD4和CD8 T細胞的浸潤（圖6J-M）。GSK3326595聯(lián)合抗PD-1促進IFN-γCD8 T細胞擴增（圖6J-M）。GSK3326595聯(lián)合抗PD-1抗體可通過緩解免疫抑制，有效增強BHLHE22前列腺癌對ICT的應(yīng)答。

圖6 蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5抑制劑聯(lián)合免疫檢查點治療在體內(nèi)可有效抑制腫瘤浸潤的免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞及骨轉(zhuǎn)移

9. BHLHE22作為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移ICT聯(lián)合治療生物標(biāo)志物的潛在作用

為了評估BHLHE22/PRMT5/CSF2軸與人骨轉(zhuǎn)移性PCa中免疫細胞浸潤的潛在相關(guān)性，作者使用IHC檢測了作者BM組織中BHLHE22、PRMT5和CSF2的表達水平（圖7A）。有證據(jù)表明，PRMT5在PCa中上調(diào)，并作為PCa細胞生長的癌基因33PRMT5在骨髓組織中普遍呈陽性表達。顯著地，與BHLHE22-low組相比，BHLHE22-high組的CD33細胞計數(shù)較高，每個HPF(400×)的CD4 T和CD8 T細胞浸潤較低，CSF2表達較高（圖7B, C）。Ki-67增殖標(biāo)志物的陽性染色表明BHLHE22在其獨特的骨TME中促進了BM的生長（圖7D）。此外，相關(guān)分析顯示BHLHE22與CD4呈負相關(guān)（圖7E）和CD8 T細胞浸潤（圖7F），與CD33細胞浸潤呈正相關(guān)（圖7G）和CSF2表達（圖7h）?？傊?，作者的研究結(jié)果揭示了在PCa中由BHLHE22/PRMT5/CSF2通路驅(qū)動的具有免疫抑制作用的骨TME和相關(guān)骨髓的分子機制（圖7I）。靶向PRMT5/CSF2聯(lián)合抗PD-1是BHLHE22前列腺癌患者潛在的治療方法。

圖7 BHLHE22作為免疫檢查點療法聯(lián)合治療骨轉(zhuǎn)移性PCa的生物標(biāo)志物的潛在作用

結(jié)論：

綜上所述，作者闡明了腫瘤BHLHE22在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的免疫抑制機制。BHLHE22與PRMT5偶聯(lián)形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，表觀遺傳激活CSF2表達，CSF2是參與免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞積累的關(guān)鍵抑制性細胞因子。腫瘤BHLHE22是一種很有前景的生物標(biāo)志物，可用于增強抗PD-1治療的療效?？笴SF2 /抗PRMT5和抗PD-1的聯(lián)合治療代表了具有BHLHE22和骨轉(zhuǎn)移的PCa患者的前瞻性治療。

參考文獻：

Yin C, Wang M, Wang Y, et al. BHLHE22 drives the immunosuppressive bone tumor microenvironment and associated bone metastasis in prostate cancer. J Immunother Cancer. 2023 Mar;11(3):e005532.