細(xì)胞外囊泡中的miR-126-5p和miR-212-3p在輻射誘導(dǎo)的血管炎癥早期激活單核細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化

實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞培養(yǎng)，Western blotting，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)測(cè)量，RNA提取，qRT-PCR，Small RNA-sequencing，生信分析，GO和KEGG分析，雙熒光素酶分析
   
      在癌癥治療和核事故中暴露于輻射的人在長(zhǎng)期存活者中心血管結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)增加。細(xì)胞外囊泡（EVs）參與輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙，但其在輻射后血管炎癥早期階段的作用尚不完全清楚。在這里，作者證明了含有miRNAs的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的EVs在輻射誘導(dǎo)的血管炎癥中啟動(dòng)單核細(xì)胞活化。體外共培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮EVs可以敏感地通過(guò)輻射暴露以劑量依賴(lài)的方式增加，并刺激單細(xì)胞釋放單核EVs和粘附到內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)增加編碼細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的特異性配體的基因的表達(dá)。小RNA測(cè)序和使用模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染解釋了富集在內(nèi)皮EVs中的miR-126-5p和miR-212-3p在輻射暴露后通過(guò)單核細(xì)胞激活啟動(dòng)血管炎癥。此外，在輻射誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠循環(huán)內(nèi)皮EVs中可以檢測(cè)到miR-126-5p，并且發(fā)現(xiàn)其與血漿致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)密切相關(guān)。綜上所述，作者的研究表明，在輻射誘導(dǎo)的血管損傷中，內(nèi)皮EVs中存在的miR-126-5p和miR-212-3p介導(dǎo)炎癥信號(hào)激活單核細(xì)胞。更好地了解循環(huán)內(nèi)皮EVs含量可以促進(jìn)其作為輻射暴露后動(dòng)脈粥樣硬化的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。研究于2023年3月發(fā)表于期刊《J Extracell Vesicles》上，IF：17.337。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：
1、循環(huán)血漿EVs的數(shù)量隨著暴露劑量的增加而增加
      為研究輻射暴露對(duì)血漿EVs的影響，作者測(cè)定0、0.1和1 Gy全身照射實(shí)驗(yàn)小鼠血漿中EVs的生成量。首先，根據(jù)2018年國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)提出的《細(xì)胞外囊泡研究的最小信息》指南對(duì)分離的EV進(jìn)行鑒定。通過(guò)納米顆粒跟蹤分析（NTA）和透射電鏡（TEM）測(cè)得的大多數(shù)EVs的粒徑小于200 nm，并通過(guò)western blot分析驗(yàn)證這些EVs的質(zhì)量和純度（圖1a-c）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到受照小鼠血漿EVs數(shù)量增加（圖1d），ImageStreamX分析直觀地證實(shí)了血漿EVs的熒光事件（圖1e）。兩種分析方法均用于增加結(jié)果的穩(wěn)健性。接下來(lái)，作者擴(kuò)大照射劑量范圍，考察0、0.1、0.5、1和5 Gy不同劑量輻射的EVs響應(yīng)（圖1f）。循環(huán)內(nèi)皮EVs水平在暴露后敏感地增加，并呈劑量依賴(lài)性，即使在低劑量（0.1 Gy）下也是如此。有趣的是，內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的EVs，如特異性標(biāo)志物CD105⁺、CD31⁺/CD42^-和146⁺的存在，以劑量依賴(lài)的方式顯著升高。其他細(xì)胞來(lái)源的EVs，標(biāo)記為CD11b ⁺（單核細(xì)胞），CD41 ⁺（血小板）和CD45 ⁺（白細(xì)胞），也顯著增加。損傷的血管結(jié)構(gòu)進(jìn)一步通過(guò)照射小鼠腸道組織中單核細(xì)胞系細(xì)胞浸潤(rùn)增加得到驗(yàn)證（圖2c），這對(duì)應(yīng)于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向小腸固有層的遷移（圖2d）。
      為探究輻射暴露對(duì)人體血漿EVs的影響，對(duì)6名健康獻(xiàn)血者的血液樣本也進(jìn)行了不同劑量的輻射（0.1 ~ 5 Gy）。在淋巴細(xì)胞中，雙著絲粒染色體和γ H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量，即已知的輻射誘導(dǎo)損傷的基因組標(biāo)記，在照射后以劑量依賴(lài)的方式增加。通過(guò)統(tǒng)計(jì)輻射特異的雙著絲粒染色體數(shù)目，計(jì)算得到的輻射實(shí)際劑量與估算劑量具有很好的相關(guān)性（圖2a）。輻射暴露增加γ H2AX指示的DNA損傷灶數(shù)目。在輻射劑量大于0.5 Gy的淋巴細(xì)胞中觀察到兩個(gè)以上的灶（圖2b）。在線性回歸模型中，以CD31⁺/CD42^-，CD105 ⁺，CD146 ⁺和CD144 ⁺標(biāo)記的人血漿EVs和內(nèi)皮EVs水平隨著輻射劑量的增加而增加，在受輻射的小鼠血液樣本中觀察到（圖2c）。除白細(xì)胞來(lái)源的EVs（CD45 ⁺）外，單核細(xì)胞（CD14 ⁺ , HLA-DR ⁺）和血小板來(lái)源的EVs（CD41 ⁺）也顯著增加。與在小鼠中觀察到的結(jié)果類(lèi)似，輻射劑量與人類(lèi)EVs產(chǎn)量呈正相關(guān)（表1）。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，輻射引起基因組和細(xì)胞損傷后，EVs從人和小鼠的血細(xì)胞中敏感地分泌。

圖1 循環(huán)血漿EVs的數(shù)量隨著暴露劑量的增加而增加

圖2 在人體血液樣本中，細(xì)胞外囊泡( EVs )是由不同類(lèi)型的細(xì)胞響應(yīng)輻射照射而釋放的

2、在共培養(yǎng)體系中，內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞在輻射暴露后的不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生EVs

      作者利用含有內(nèi)皮細(xì)胞（Huvecs）和單核細(xì)胞（Thp-1Cells）的共培養(yǎng)體系來(lái)探討輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞通訊在血管結(jié)構(gòu)中的作用。作者首先檢測(cè)了輻射暴露后共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的EV水平。內(nèi)皮EVs（CD105和CD31陽(yáng)性）在輻射暴露（暴露后4 h）后的早期時(shí)間點(diǎn)顯著增加，并在24和48 h消失（圖3a）。單核EVs（CD11b、HLA-DR陽(yáng)性）的增加在暴露后24 h才被檢測(cè)到（圖3b）。這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞可以通過(guò)增加EVs的產(chǎn)生來(lái)應(yīng)對(duì)輻射暴露，細(xì)胞特異性EVs在照射后的不同時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值。單核細(xì)胞粘附是炎癥反應(yīng)的初始步驟，在輻射暴露后24 h，單核細(xì)胞粘附被激活（圖3c），單核細(xì)胞粘附分子LFA1和Mac1表達(dá)升高（圖3d）。相應(yīng)地，在輻射后24和48 h，內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICAM-1和ICAM-2的表達(dá)也增加（圖3e）。兩種細(xì)胞均表現(xiàn)出伴隨EVs產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子表達(dá)增加。具體來(lái)說(shuō)，HUVECs中TNF-α、干擾素（INF）-γ和白細(xì)胞介素（IL）-在4 h高表達(dá)，但在24 h消失，這與內(nèi)皮EVs的產(chǎn)生平行（圖3f）。在THP-1細(xì)胞中，這些細(xì)胞因子在輻射暴露后24 h表達(dá)增加，即觀察到粘附活性增強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)（圖3g）。這些數(shù)據(jù)表明，在作者的血管共培養(yǎng)體系中，輻射首先誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎信號(hào)，導(dǎo)致單核EVs的產(chǎn)生和單核細(xì)胞的激活，隨后發(fā)生一系列復(fù)雜的細(xì)胞因子反應(yīng)。

圖3 內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞EVs在輻射暴露后的不同時(shí)間點(diǎn)釋放

3、輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs可促進(jìn)單核細(xì)胞活化，且不依賴(lài)于輻射暴露

      為檢測(cè)輻射后產(chǎn)生的內(nèi)皮EVs是否可以直接誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化，在輻射后4 h，用HUVEC-THP-1共培養(yǎng)上清中分離的EVs處理未經(jīng)輻射的THP-1細(xì)胞。輻射暴露顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞EVs的數(shù)量，但并沒(méi)有增加培養(yǎng)液中單核細(xì)胞EVs的數(shù)量（圖4a）。EVs攝取實(shí)驗(yàn)顯示HUVECs來(lái)源的EVs很容易被未照射的THP-1細(xì)胞攝?。▓D4b）。與內(nèi)皮細(xì)胞EVs共孵育24 h后，觀察受體單核細(xì)胞中EVs的產(chǎn)生（圖4c）。相反，當(dāng)THP-1細(xì)胞與EVs耗竭的條件培養(yǎng)基孵育時(shí)，單核細(xì)胞來(lái)源的EVs沒(méi)有增加。令人驚訝的是，作者觀察到THP-1細(xì)胞經(jīng)輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs處理后，其表面粘附分子表達(dá)增加，與直接輻射暴露后觀察到的水平相當(dāng)（圖4d）。值得注意的是，隨著內(nèi)皮EVs濃度的增加，THP-1細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)顯著增加（圖4e）。這一發(fā)現(xiàn)與輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs處理的單核細(xì)胞表面標(biāo)志基因表達(dá)升高相互印證（圖4f）?？傊@些數(shù)據(jù)表明輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs可以直接刺激單核細(xì)胞的粘附活性，即使在沒(méi)有輻射暴露的情況下。

圖4 來(lái)自輻照共培養(yǎng)的內(nèi)皮EVs在體外誘導(dǎo)非輻照單核細(xì)胞的活化

4、輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs可以在非輻射小鼠中啟動(dòng)免疫反應(yīng)
      為研究輻射誘導(dǎo)的內(nèi)皮EVs在小鼠體內(nèi)的潛在作用，將輻射后24 h的小鼠血漿EVs通過(guò)尾靜脈注射到非輻射小鼠體內(nèi)（圖5a）。與單核細(xì)胞EVs相比，內(nèi)皮細(xì)胞EVs在輻射暴露后顯著增加（圖5b-c）。接受輻射誘導(dǎo)的EVs的小鼠在外周血和脾臟中顯示髓系細(xì)胞的增加，但在骨髓中沒(méi)有，包括中性粒細(xì)胞（CD45 ⁺ / CD11b ⁺ / Ly6G ⁺）和巨噬細(xì)胞（CD45 ⁺ / CD11b ⁺ / F4 / 80 ⁺），已知的急性炎癥免疫細(xì)胞（圖5d）。值得注意的是，在血液和脾臟中也檢測(cè)到白細(xì)胞粘附分子如LFA1和Mac1的表達(dá)增加，但在骨髓中沒(méi)有檢測(cè)到（圖5e）。利用細(xì)胞因子芯片，作者發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)皮功能障礙相關(guān)標(biāo)志物，包括胱抑素C（CST3），CD105，幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1（CHI3L1）和絲氨酸蛋白酶抑制劑F1（SERPINF1），在輻射誘導(dǎo)的EVs處理的動(dòng)物淋巴細(xì)胞中高表達(dá)（圖5f）。此外，中性粒細(xì)胞標(biāo)志物（C1qR1和MPO）和中性粒細(xì)胞募集趨化因子（MMP9和CXCL5）的表達(dá)在輻射誘導(dǎo)的EVs處理后增加?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，從受照小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移EVs可以通過(guò)急性炎癥細(xì)胞的擴(kuò)增，系統(tǒng)性地啟動(dòng)受體小鼠的免疫激活。

圖5 輻照小鼠血漿EVs誘導(dǎo)非輻照小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答

5、內(nèi)皮EVs中的miR^-126和miR^-212傳遞給對(duì)輻射暴露有反應(yīng)的單核細(xì)胞
      以往的研究表明，EVs中的miRNA能夠在細(xì)胞間傳遞炎癥信號(hào)。miRNA能夠靶向多個(gè)與多種疾病相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因。為分析miRNAs，在1Gy照射后從小鼠血漿中分離出內(nèi)皮EVs，并進(jìn)行小RNA測(cè)序。利用85個(gè)在輻射和對(duì)照樣品中差異表達(dá)的miRNAs（倍數(shù)變化閾值為1.5）構(gòu)建Aheatmap（圖6a）。使用DIANA-mirPath軟件對(duì)這些差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行通路分析，并使用R編程語(yǔ)言中的DESeq2包測(cè)量統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在顯著變化的29個(gè)miRNA（p < 0.05）中，通過(guò)對(duì)輻射響應(yīng)相關(guān)miRNA的文獻(xiàn)調(diào)研，篩選出10個(gè)候選miRNA（圖6b和表2）。qRT-PCR驗(yàn)證候選miRNAs在輻射后4 h共培養(yǎng)的HUVECs和內(nèi)皮EVs，以及轉(zhuǎn)移后24 h內(nèi)皮EVs處理的THP-1細(xì)胞中的表達(dá)模式。在10個(gè)miRNAs中，有6個(gè)miRNAs在輻射后內(nèi)皮EVs中的表達(dá)模式發(fā)生了顯著變化（圖6c）。其中，miR-126-5p和miR-212-3p在輻射后的HUVECs和內(nèi)皮EVs以及內(nèi)皮EVs處理的THP-1細(xì)胞中表達(dá)顯著增加（圖6d-e）。電離輻射后，少數(shù)miRNAs如miR-10a-5p、miR-29b-3p、miR-142-5p和miR-146b-5p在內(nèi)皮EVs中表達(dá)降低，但在HUVECs和THP-1細(xì)胞中的表達(dá)模式不一致。這些結(jié)果表明，當(dāng)血管細(xì)胞受到輻射時(shí)，miR-126-5p和miR-212-3p可以通過(guò)EVs從內(nèi)皮細(xì)胞傳遞到單核細(xì)胞。

圖6 EVs在血液中響應(yīng)輻射暴露而釋放

6、miR-126和miR-212促進(jìn)單核細(xì)胞粘附以應(yīng)對(duì)輻射暴露
      為證明內(nèi)皮EVs可以將輻射誘導(dǎo)的損傷信號(hào)從內(nèi)皮細(xì)胞傳遞到炎癥細(xì)胞，作者使用模擬物和抑制劑來(lái)研究miR-126-5p和miR-212-3p的功能。抑制劑處理降低了與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后HUVECs中靶miRNA的表達(dá)（圖7a）。此外，HUVECs轉(zhuǎn)染miR-126-5p和miR-212-3p抑制劑后，共培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞在輻射后24 h黏附分子的表達(dá)降低（圖7b），這與作者之前在THP-1細(xì)胞上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，如圖4d所示。未經(jīng)輻射照射的共培養(yǎng)THP-1細(xì)胞中細(xì)胞黏附分子的表達(dá)無(wú)變化。此外，使用miR-126-5p或miR-212-3p mimic轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)未照射的THP-1細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)（圖7d）。miR-126-5p和miR-212-3p模擬物轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后，即使沒(méi)有輻射照射，細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)也增加，與輻射后的THP-1細(xì)胞相似。作者使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了這兩個(gè)miRNA的直接和特異性調(diào)控。熒光素酶報(bào)告載體含有與miR-126-5p或miR-212-3p靶基因的結(jié)合序列相匹配的序列，可能為antago-miRNA。mi RNAs模擬物轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后，與其配對(duì)的靶位點(diǎn)熒光素酶活性明顯降低（圖7e）。此外，通過(guò)與每個(gè)miRNA特異的antago-miRNA構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告載體，轉(zhuǎn)染miR-126-5p或miR-212-3p的模擬物后，粘附分子的表達(dá)顯著降低（圖7f）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明miR-126-5p和miR-212-3p均介導(dǎo)了輻射后單核細(xì)胞通過(guò)騎乘內(nèi)皮細(xì)胞的EVs而發(fā)揮粘附活性所需的刺激信號(hào)。

圖7 miR-126-5p和miR-212-3p介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞到單核細(xì)胞的輻射誘導(dǎo)損傷信號(hào)

7、miR-126和miR-212促進(jìn)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化
      接下來(lái)作者研究了miR-126-5p和miR-212-3p對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響。在與內(nèi)皮細(xì)胞粘附后，循環(huán)單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜區(qū)域并分化為巨噬細(xì)胞。這些巨噬細(xì)胞可以攝取ox-LDL顆粒并在炎癥過(guò)程中轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。用miRNA mimics處理THP-1細(xì)胞后，PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分化顯著增加（圖8a）。此外，ox-LDL處理THP-1源性巨噬細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，細(xì)胞呈現(xiàn)泡沫細(xì)胞形態(tài)。用miRNA模擬物處理THP-1細(xì)胞后，泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)積累也增加（圖8b-c）。此外，miRNA mimics處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯的水平也增加（圖8d-e）。與miR-126-5p mimic相比，miR-212-3p mimic處理后巨噬細(xì)胞分化和泡沫細(xì)胞形成略有增強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明，miR-126-5p和miR-212-3p可以促進(jìn)單核細(xì)胞分化和泡沫細(xì)胞形成，而這被認(rèn)為是與動(dòng)脈粥樣硬化等慢性炎癥性疾病相關(guān)的主要病理特征。

圖8 MiR-126-5p和miR-212-3p促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化和ox-LDL攝取

8、輻射誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化Ldlr^-/-小鼠血漿EVs及其貨物miR^-126-5p水平升高
      在證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的EVs可促進(jìn)輻射后單核細(xì)胞黏附導(dǎo)致炎癥的基礎(chǔ)上，作者接下來(lái)評(píng)估在具有代表性的輻射誘導(dǎo)炎癥性疾病模型-^-輻射誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中是否可以檢測(cè)到類(lèi)似的EVs。通過(guò)評(píng)估輻射暴露Ldlr^-/-小鼠主動(dòng)脈根部脂質(zhì)斑塊的形成，驗(yàn)證了輻射誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的成功發(fā)展（圖9a）。通過(guò)測(cè)量輻照小鼠的血脂水平，包括總膽固醇、總甘油三酯和高密度膽固醇來(lái)評(píng)估冠心病的致動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)（圖9b）。輻射后Ldlr^-/-小鼠血漿EVs數(shù)量與輻射后動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)成正比（圖9c）。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)在輻射誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠血漿EVs中，miR-126-5p的水平顯著升高，而miR-212-3p的水平?jīng)]有顯著變化。此外，Pearson ' s相關(guān)分析顯示斑塊形成、EVs分泌和EVs中miR-126-5p表達(dá)與放射性動(dòng)脈粥樣硬化臨床風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)相關(guān)（圖9f-h）。總之，這些數(shù)據(jù)表明EVs中存在的miR-126-5p可以介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中輻射誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)。此外，血漿EVs及其貨物miR-126-5p可用于評(píng)估輻射后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

圖9 輻射誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化Ldl ^-/-小鼠血漿內(nèi)皮細(xì)胞及其載貨量增加

圖10 機(jī)制圖

參考文獻(xiàn)
Choi, Y. Y., Kim, A., Lee, Y., Lee, Y. H., Park, M., Shin, E., Park, S., Youn, B., & Seong, K. M.（2023）. The miR-126-5p and miR-212-3p in the extracellular vesicles activate monocytes in the early stage of radiation-induced vascular inflammation implicated in atherosclerosis. Journal of Extracellular Vesicles, 12, e12325. https://doi.org/10.1002/jev2.12325