剩飯新炒的Stomatin依舊可以發(fā)高分

實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)成脂分化，BSA偶聯(lián)棕櫚酸的制備與處理，慢病毒包裝和感染，脂質(zhì)滴分離，脂質(zhì)積累定量，WB，免疫熒光（IF），免疫共沉淀（IP），脂質(zhì)組學(xué)分析，熒光漂白恢復(fù)（FRAP）實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞表面生物素化，鄰位連接技術(shù)（PLA），脂肪酸攝取實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建，小鼠表型分析，葡萄糖耐量試驗(yàn)，病理學(xué)分析，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

       脂肪酸攝取、脂質(zhì)產(chǎn)生和儲(chǔ)存以及脂滴代謝的調(diào)節(jié)與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、脂肪細(xì)胞肥大和肥胖密切相關(guān)。本文發(fā)現(xiàn)stomatin是脂筏的主要成分，通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路參與脂肪生成和脂肪細(xì)胞成熟；在脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞中，增加的stomatin通過促進(jìn)LD-LD融合來促進(jìn)LD的生長(zhǎng)或擴(kuò)大；stomatin還通過將效應(yīng)分子（如FAT/CD36易位酶）募集到脂筏中來促進(jìn)脂肪酸的內(nèi)化，從而促進(jìn)脂肪酸從細(xì)胞外環(huán)境中的攝取。高脂飲食喂食（HFD）的氣孔蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出肥胖、胰島素抵抗和肝臟損傷；然而，在用常規(guī)飲食喂養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中沒有觀察到這種表型；通過基因敲低或OB-1抑制stomatin通過下調(diào)PPARγ途徑抑制脂肪分化和LD生長(zhǎng)；stomatin對(duì)PPARγ的影響涉及ERK信號(hào)傳導(dǎo)；然而，也可能存在其余途徑。本研究于2022年7月發(fā)表在《Nature Communications》IF：17.694期刊。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、脂肪形成過程中stomatin表達(dá)增加
       為探究脂肪細(xì)胞分化，建立細(xì)胞模型：MD處理小鼠3T3-L1成纖維細(xì)胞3天，隨后胰島素處理第3 ~ 7天，使這些細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞，油紅O染色可觀察到細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積（圖1a）。這些細(xì)胞表達(dá)stomatin和主要脂肪細(xì)胞基因，如PPARγ，C/EBPα，Perilipin（圖1b）。在第7天，這些脂肪樣細(xì)胞中在DIC顯微鏡下可觀察到大的脂質(zhì)滴（LD）；免疫熒光染色顯示stomatin的亞細(xì)胞分布，除了細(xì)胞質(zhì)中的點(diǎn)狀染色外，在質(zhì)膜（箭頭所示）以及LD的表面也可見stomatin蛋白（圖1c）。在STED顯微鏡下檢查時(shí)，stomatin部分地與周圍磷脂蛋白共定位（圖1d）。當(dāng)從脂肪樣細(xì)胞中分離出LD時(shí)，LD中存在stomatin以及已知的LD相關(guān)蛋白磷脂蛋白（圖1e）。

圖1 在脂肪形成過程中，stomatin表達(dá)增加

2、高水平的stomatin促進(jìn)LD增大
       在小鼠3T3-L1細(xì)胞中過表達(dá)人stomatin基因（hSTOM），這些細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為脂肪樣細(xì)胞，結(jié)果顯示過表達(dá)stomatin不影響脂肪分化，通過比較脂質(zhì)積累（圖2a）和脂肪基因的表達(dá)（圖2b）。通過測(cè)定單個(gè)LD的大小，發(fā)現(xiàn)stomatin過表達(dá)細(xì)胞中LD更大（圖2c）。通過兩個(gè)小LD的融合可以形成一個(gè)大LD。延時(shí)記錄表明在過度表達(dá)stomatin的脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞中存在這樣的LD-LD融合事件（圖2d）。
或者，大的LD可能是由較小的LD囊泡逐步“填充”脂質(zhì)含量導(dǎo)致的，有些在光學(xué)顯微鏡下看不清。作者利用FRAP實(shí)驗(yàn)來研究這種可能性。如圖2e所示，如圖2e所示，在過表達(dá)stomatin的脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞中，LD的光漂白熒光含量導(dǎo)致了更快的熒光恢復(fù)（綠色，頂部痕跡），相比之下，對(duì)照細(xì)胞的熒光恢復(fù)要少得多、慢得多（藍(lán)色，底部痕跡）。
       在體外測(cè)量LD-LD融合事件（圖2f，g）。從細(xì)胞中分離出LD，其LD被加載綠色Bodipy-FL-C16或紅色Bodipy-558/568-C12熒光標(biāo)記的脂肪酸類似物（箭頭，圖2g）。一些LD在體外混合時(shí)，似乎發(fā)生了融合，形成了黃色的LD（箭頭，圖2g），因?yàn)樗鼈兺瑫r(shí)含有熒光的脂肪酸類似物。LD-LD融合的程度可以通過計(jì)算融合的LD百分比來量化。由于stomatin可以分泌到培養(yǎng)基中，作者注意到，與從對(duì)照組細(xì)胞收獲的條件培養(yǎng)基（CM-Ctl）相比，添加從過表達(dá)stomatin的細(xì)胞中獲得的條件培養(yǎng)基（CM-hSTOM）會(huì)導(dǎo)致融合的LDs百分比增加。有趣的是，通過用抗stomatin抗體處理?xiàng)l件培養(yǎng)基來消耗stomatin，有效地抑制了這種融合促進(jìn)活性（圖2g）。

圖2 stomatin過表達(dá)促進(jìn)脂肪樣細(xì)胞LD的生長(zhǎng)和融合

3、高水平stomatin促進(jìn)脂肪酸攝取并且stomatin被招募到質(zhì)膜上與CD36相互作用
       作者使用IP使用鑒定和stomatin結(jié)合的蛋白，共鑒定到885個(gè)候選蛋白，其中183個(gè)蛋白存在于質(zhì)膜（PM），包括CD36和CAV1，它們與脂質(zhì)儲(chǔ)存相關(guān)。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)stomatin與CD36的分子相互作用（圖3a）。熒光標(biāo)記的棕櫚酸類似物Bodipy-FL-C16，當(dāng)添加到培養(yǎng)基中時(shí)，被3T3-L1脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞內(nèi)化。吸收過程可以通過測(cè)量細(xì)胞內(nèi)熒光的增加來持續(xù)監(jiān)測(cè)（圖3b）。過表達(dá)stomatin的脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞（綠色）比對(duì)照組細(xì)胞（藍(lán)色）表現(xiàn)出更多和更快的脂肪酸吸收。這樣的效果不是由擴(kuò)散引起的。在過表達(dá)stomatin（灰色痕跡）和對(duì)照組脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞（黑色痕跡）之間的Bodipy-FL攝取效率沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化。
Stomatin不僅促進(jìn)脂肪酸的吸收，而且在這個(gè)內(nèi)化過程中從LD表面重新分布到質(zhì)膜上。如圖3c所示，當(dāng)用BSA作為對(duì)照處理細(xì)胞時(shí)，在被檢查的大約一半脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞中，stomatin蛋白以高豐度存在于LD周圍。然而，當(dāng)用BSA結(jié)合的棕櫚酸（PA）處理這些細(xì)胞15分鐘時(shí)，大多數(shù)與LD相關(guān)的stomatin似乎與LD "解離"，出現(xiàn)在質(zhì)膜上或分散在細(xì)胞膜上。
       位于細(xì)胞表面的膜蛋白的數(shù)量可以用表面生物素化的方法進(jìn)行標(biāo)記，并與細(xì)胞內(nèi)的蛋白分別進(jìn)行量化。如圖3d所示，計(jì)算了相對(duì)于總蛋白（輸入），stomatin、CAV-1、CD36和ATP1A1的表面生物素化部分（表面）。只存在于細(xì)胞內(nèi)部的肌動(dòng)蛋白被用作對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與BSA處理相比，用PA處理細(xì)胞時(shí)，CAV-1、CD36和ATP1A1的表面部分仍然沒有變化。相反，用PA處理脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞時(shí)，stomatin的表面部分比用BSA處理時(shí)有所增加（箭頭）。這樣的增加可能是由于PA的吸收引發(fā)了stomatin從LD或其他細(xì)胞內(nèi)室被招募到質(zhì)膜上，促進(jìn)了來自細(xì)胞外環(huán)境的脂質(zhì)成分的內(nèi)化。
       使用PLA進(jìn)一步原位分析了stomatin和其他LD相關(guān)蛋白，如CD36或CAV-1之間的分子相互作用。如圖3e所示，當(dāng)用PA處理3T3-L1脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞時(shí)，PLA+位點(diǎn)顯著增加，表明stomatin和CD36之間沿質(zhì)膜分子結(jié)合（箭頭）。撤消PA處理可以逆轉(zhuǎn)這種stomatin-CD36的相互作用。相反，PA處理并不影響stomatin和CAV-1之間的相互作用（圖3f）。
以上表明STOM招募到質(zhì)膜上并與CD36相互作用

圖3 stomatin與CD36互作促進(jìn)脂肪酸攝取

4、STOM升高導(dǎo)致喂HFD小鼠肥胖
       研究飲食對(duì)stomatin表達(dá)的影響。野生型小鼠（WT）用普通飼料（CD）或高脂肪飲食（HFD）喂養(yǎng)20周。收集脂肪墊，并通過qPCR檢測(cè)stomatin（圖4a）。與CD喂養(yǎng)的小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的小鼠皮下（SAT）和內(nèi)臟（VAT）白色脂肪組織中mSTOM的mRNA增加，但這種增加在棕色脂肪組織（BAT）中不太明顯。
       STOM轉(zhuǎn)基因（STOM Tg）小鼠是通過將人類stomatin基因工程到動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的。這些小鼠在SAT中含有大量的hSTOM蛋白（圖4b），這些蛋白主要在白色脂肪細(xì)胞的表面膜上（圖4c）。STOM Tg和對(duì)照組WT小鼠自3周歲起用CD或HFD喂養(yǎng)20周；每周對(duì)它們進(jìn)行稱重（圖4d）。當(dāng)用CD喂養(yǎng)時(shí)，STOM Tg與WT小鼠的體重增加相似。然而，當(dāng)用HFD喂養(yǎng)時(shí)，STOM Tg小鼠比WT更快地增加體重（圖4d，e）。在HFD喂養(yǎng)20周后，STOM Tg小鼠的體重比WT小鼠至少高17%。全身成分測(cè)量顯示，脂肪的增加比瘦肉、自由液體或總水的增加更明顯（平均增加32%）（圖4f）。
       體內(nèi)脂肪酸攝取實(shí)驗(yàn)是通過將BSA乳化的Bodipy-FL-C16注射到小鼠的尾靜脈，孵化15分鐘，然后測(cè)量動(dòng)物白色脂肪組織中的熒光信號(hào)（圖4g）。觀察到到STOM Tg小鼠比WT小鼠有更多的脂肪酸吸收到脂肪組織中（圖4g）。
       以上表明，在體內(nèi)stomatin轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪攝取更多更快，小鼠更肥胖。

圖4相比于對(duì)照小鼠高脂飲食喂養(yǎng)的stomatin轉(zhuǎn)基因小鼠更加肥胖

5、HFD喂養(yǎng)stomatin轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪細(xì)胞肥大與代謝紊亂
       經(jīng)過20周的HFD喂養(yǎng)，具有上調(diào)stomatin的小鼠顯示出比WT小鼠更多的SAT和BAT的質(zhì)量，而他們的VAT組織相對(duì)保持不變（圖5a）。組織學(xué)分析顯示，在HFD喂養(yǎng)的STOM Tg小鼠中，SAT的脂肪細(xì)胞出現(xiàn)肥大，并且比WT小鼠的脂肪細(xì)胞大小更大（圖5b）。如圖5c所示，雖然STOM Tg和WT小鼠的空腹血糖水平相似，但通過HOMA-IR實(shí)驗(yàn)測(cè)得的血漿胰島素和胰島素抵抗明顯升高，通過腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPTGG）測(cè)得的葡萄糖耐量在HFD喂養(yǎng)的STOM Tg比對(duì)照組小鼠更難耐受。肥胖通常與肝臟中的異位脂肪堆積有關(guān)。事實(shí)上，HFD喂養(yǎng)的STOM Tg小鼠表現(xiàn)出更大的肝臟質(zhì)量（肝臟腫大），以及大泡和小泡的脂肪變性。這些表型與肝功能受損有關(guān)，血清中GPT和GOP水平的升高就是證明（圖5d）。

圖5 高脂飲食喂養(yǎng)的stomatin轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出脂肪細(xì)胞肥大與代謝紊亂

6、敲低STOM阻斷脂肪生成和LD變大
       將兩種針對(duì)小鼠stomatin基因不同位點(diǎn)的shRNA分別包裝在慢病毒顆粒中并導(dǎo)入3T3-L1細(xì)胞，得到shSTOM-1和shSTOM-2細(xì)胞。兩種shRNAs都能有效地下調(diào)stomatin的表達(dá)。敲除stomatin抑制了脂肪生成，這一點(diǎn)從誘導(dǎo)分化后缺乏脂質(zhì)積累得到證明（圖6a）。參與脂肪細(xì)胞分化的基因的表達(dá)，如PPARγ和C/EBPα，因stomatin敲除而減少（圖6b）。STOM的下調(diào)也抑制了LD的成熟和生長(zhǎng)（圖6c）。
       比較stomatin敲低和對(duì)照組3T3-L1脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜。共鑒定到379個(gè)轉(zhuǎn)錄物有顯著差異，包括185個(gè)上調(diào)的基因和194個(gè)下調(diào)的基因。使用轉(zhuǎn)錄組分析控制臺(tái)（TAC）將這些基因映射到128條Wikipathways上，排名靠前的富集途徑如圖6d示。在"脂肪生成基因 "通路中，涉及該通路的12個(gè)基因顯著差異，其中9個(gè)（75%）被下調(diào)，3個(gè)（25%）被上調(diào)（圖6e）。為進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)是脂肪生成相關(guān)基因Pparg、Cebpa、Dlk-1、Fabp4和Cfd基因（圖6f）；除了Dlk-1，所有這些基因都被下調(diào)了。

圖6降低stomatin表達(dá)影響脂肪生成并抑制脂滴生長(zhǎng)

7、STOM通過ERK通路調(diào)節(jié)脂肪形成
       如圖7a所示，敲除stomatin導(dǎo)致PPARγ的減少。Akt途徑?jīng)]有受到STOM敲除的影響，而ERK途徑被激活（箭頭）。脂肪生成基因C/EBPβ和C/EBPδ是PPARγ調(diào)節(jié)的上游。在誘導(dǎo)脂肪生成分化后，C/EBPβ和C/EBPδ，在前三天表現(xiàn)出短暫的增加，隨后從第三天到第七天逐漸減少（圖7b-c）。在stomatin敲除的3T3-L1脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)stomatin的缺乏在第7天引起C/EBPβ的減少（圖7b）。相比之下，stomatin敲除能夠維持或增加C/EBPδ的表達(dá)，使之達(dá)到比對(duì)照組高得多的水平（圖7c）。
       ERK途徑的激活已被證明可抑制PPARγ，從而禁止脂肪細(xì)胞的分化和脂肪生成。U0126是一種高度選擇性的ERK抑制劑。用U0126處理shSTOM-1脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞，理論上U0126可能減輕stomatin敲低對(duì)pERK激活的影響。然而，U0126處理并沒有扭轉(zhuǎn)hSTOM-1細(xì)胞的脂質(zhì)積累不足的表型（圖7d）。相反，用PPARγ激動(dòng)劑TGZ處理shSTOM-1細(xì)胞，能夠部分挽救脂質(zhì)積累缺陷；有趣的是，U0126和TGZ的雙重處理可以進(jìn)一步促進(jìn)脂質(zhì)積累（圖7e）。這些結(jié)果表明，stomatin存在一種目前未知的機(jī)制，可以正向調(diào)節(jié)PPARγ并激活脂肪生成，而不依賴于ERK。

圖7 敲低Stomatin激活ERK通路

       Stomatin的功能抑制可以通過藥理試劑OB-138實(shí)現(xiàn)，該試劑通過干擾Stomatin的自我結(jié)合，抑制Stomatin的活性。首先確定了OB-1的LD50（圖8a）。用OB-1處理3T3-L1脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞，以劑量依賴的方式有效減少了脂質(zhì)積累（圖8b）。OB-1處理后，LD的大小也減少（圖8c），磷酸化ERK的水平增加（圖8d）。

圖8 Stomatin抑制劑OB-1抑制脂肪生成，阻礙脂滴生長(zhǎng)

       總之，提出了stomatin在調(diào)節(jié)成脂分化和調(diào)節(jié)LD生長(zhǎng)和脂肪細(xì)胞攝取脂肪酸中的作用的工作模型（圖9a）。

圖9圖解模型說明了誘導(dǎo)成脂分化過程中動(dòng)態(tài)基因表達(dá)和stomatin在促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂肪酸攝取和脂滴增大中的作用

參考文獻(xiàn)：
       Wu SC, Lo YM, Lee JH, Chen CY, Chen TW, Liu HW, Lian WN, Hua K, Liao CC, Lin WJ, Yang CY, Tung CY, Lin CH. Stomatin modulates adipogenesis through the ERK pathway and regulates fatty acid uptake and lipid droplet growth. Nat Commun. 2022 Jul 19;13(1):4174. doi: 10.1038/s41467-022-31825-z. PMID: 35854007